右美托咪定对心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用及机制研究

李晓滨，白建云，赵启兵

(1.宝鸡市中医医院麻醉手术科，陕西 宝鸡 721001；2.榆林市第三医院麻醉科，陕西 榆林 719000；3.安康市人民医院麻醉科，陕西 安康 725029)

一般情况下，缺血心肌组织经血液再灌注后，其结构和功能可得到恢复。缺血患者恢复血液灌注后的这种损伤程度与缺血持续时间、侧支循环状况、需氧量、再灌注状况密切相关[1]，也可能与需氧自由基爆发、超负荷Ca2+、内皮细胞功能障碍和线粒体损伤等有关[2]。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一种新型α2-肾上腺素能受体激动剂，具有高特异性，临床上用于镇静、镇痛和抗焦虑，其呼吸抑制比其他镇静剂少得多，药效也很快消失，不会让患者昏昏欲睡[3]。研究[4]表明，Dex降低了术后心脏相关并发症的风险，包括心肌缺血再灌注损伤 (Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)和心律失常，显示出心脏保护作用。研究[5]表明，心脏手术期间使用Dex与较低的术后病死率、较少的并发症和心脏手术结果的改善相关。此外，动物研究[6]表明，Dex预处理通过抑制炎症反应来减轻MIRI。因此，Dex可能是治疗MIRI的一种有前途的治疗药物。鉴于此，本研究探讨Dex对MIRI大鼠的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠36只，体重200～260 g，购自陕西医药控股集团生物制品有限公司，许可证号：SYXK(陕)2018-010。所有大鼠均在(24±1)℃、14 h∶10 h光/暗循环(即每24 h光照14 h)下饲养，并自由进食和饮水。

1.2 主要试剂 Dex(国药准字H20110085)购自江苏恩华药业股份有限公司；miR-146a模拟物、miR-146a抑制剂(批号：4464061)购自美国Thermo Fisher公司；乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(批号：C0016)购自上海碧云天生物科技有限公司；Apo DETECT Annexin V-FITC试剂盒(批号：331200)、Ribo PureTMRNA纯化试剂盒(批号：AM1924)购自美国Thermo Fisher公司。

1.3 MIRI模型制备与分组处理 所有大鼠随机分为对照组、MIRI模型组(MIRI组)和Dex治疗组(MIRI+Dex组)，每组12只。MIRI组和MIRI+Dex组的24只大鼠用于建立MIRI模型：将大鼠麻醉后，于第5肋间剪开胸壁，逐层暴露心脏，在大鼠左耳下缘处用6-0缝合线穿入左冠状动脉前降支，深度约1.5 mm，平稳后收紧结扎线，缺血30 min后再进行灌注3 h。当心电图ST段显示弓背向上抬高、心外膜颜色变成灰白色且出现充血、心肌呈紫色后迅速消失，表示建模成功。MIRI+Dex组大鼠腹腔注射50 mg/kg Dex，对照组和MIRI组大鼠腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.4 心肌细胞培养及转染 将实际大鼠心脏剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的组织块，加入10 ml质量分数为0.08%的胰蛋白酶消化8 min后静置，弃上清。向上清液中加入30%体积DMEM培养基(含15%胎牛血清)以终止消化作用，1200 r/min离心12 min后所得沉淀用约20 ml培养基轻轻吹散，200目孔径钢网过滤后移入培养瓶中进行差速贴壁，55 min后取细胞悬液以1000 r/min离心10 min，所得沉淀用培养基(pH 7.2)轻轻吹散。进行细胞计数，以5×108/L密度接种到培养瓶中，37 ℃培养24 h。miR-146a模拟物(5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’)、miR-146a抑制剂(5’-AACCCAUGGAAUUCAGUU-CUCA-3’)和阴性对照(NC，5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’)由上海基因制药合成公司提供，并根据制造商方案通过LipofectamineTM2000转染试剂转染心肌细胞。

1.5 心肌细胞分组 为研究miR-146a在Dex对MIRI大鼠心肌细胞作用中的机制，将细胞分为NC组(对照组大鼠心肌细胞)、抑制剂组(对照组大鼠心肌细胞转染miR-146a抑制剂)、MIRI+NC组(MIRI组大鼠心肌细胞)、MIRI+抑制剂组(MIRI组大鼠心肌细胞转染miR-146a抑制剂)、Dex+MIRI+NC组(MIRI+Dex组大鼠心肌细胞)和Dex+MIRI+抑制剂组(MIRI+Dex组大鼠心肌细胞转染miR-146a抑制剂)。为验证丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是否参与了Dex对MIRI损伤心肌细胞的作用机制，将心肌细胞分为对照组(仅用培养基处理大鼠心肌细胞)、SB组[p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制剂SB203580，大鼠心肌细胞用0.5 μmol/L SB预处理2 h]、MIRI组(MIRI组大鼠心肌细胞)、MIRI+SB组(MIRI组大鼠心肌细胞用0.5 μmol/L SB预处理2 h)、Dex+MIRI组(MIRI+Dex组大鼠心肌细胞)和Dex+MIRI+SB组(MIRI+Dex组大鼠心肌细胞用0.5 μmol/L SB预处理2 h)。

1.6 LDH、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平测定 培养24 h后，采用LDH检测试剂盒、脂质过氧化法测定LDH和SOD活性以及MDA水平。收集4.5×106个细胞，加入反应混合物，在37 ℃下孵育，然后在最佳波长处测量光密度(OD)值，所有参数均根据协议设置。

1.7 细胞凋亡率和活性氧(ROS)水平评估 培养24 h后，使用Mito SOXTMRed测定ROS水平：收集每组4.5×106个细胞转移到装有0.5 ml完全磷酸盐缓冲液的试管中，将试管在37 ℃下通过摇动20 min进行孵育，然后用0.5 ml完全磷酸盐缓冲液(在37 ℃下预热)洗涤细胞2次，再将细胞悬液加载到流式细胞仪上，检测ROS水平。使用Apo DETECT Annexin V-FITC 试剂盒检测细胞凋亡率：收集4.5×106个细胞，加入195 μl Annexin-V结合溶液、6 μl Annexin-V和4 μl碘化丙啶，将细胞在25 ℃下进一步培养20 min，加载到流式细胞仪上以检测细胞凋亡率。

1.8 定量实时PCR(qPCR)检测目的基因 使用TRIzol提取心肌细胞总RNA。使用Ribo PureTMRNA纯化试剂盒反转录RNA。反应体系包含2×SYBER Green master mix 10 μl、cDNA模板1.5 μl、正向引物(10 μmol/L)1 μl、反向引物(10 μmol/L)1 μl和ddH2O 6.5 μl。扩增程序设置为95 ℃ 2 min热启动，然后进行40个循环的3步PCR(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s)。引物序列见表1。将mRNA水平标准化为β-actin。目的基因包括葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、下游靶基因C/EBP家族同源蛋白(CHOP)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、醌氧化还原酶1(NQO1)、过氧化氢酶(CAT)和miR-146a。

表1 各基因引物序列

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织miR-146a、氧化应激指标、ERS指标及细胞活力与凋亡水平比较 见表2。MIRI组miR-146a水平、SOD活性和细胞活力低于对照组，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP水平、细胞凋亡率高于对照组(均P<0.05)。MIRI+Dex组miR-146a表达水平、SOD活性和细胞活力高于MIRI组，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP水平、细胞凋亡率低于MIRI组(均P<0.05)。推测Dex可能能够提高miR-146a，并通过下调MIRI损伤的大鼠心肌细胞中的氧化应激和ERS指标，导致细胞活力增加和细胞凋亡率降低。

表2 各组大鼠心肌组织miR-146a、氧化应激指标、ERS指标及细胞活力与凋亡水平比较

2.2 各组大鼠心肌细胞miR-146a mRNA、ROS及细胞活力水平比较 见表3。抑制剂组和MIRI+NC组细胞活力和miR-146a mRNA相对表达量明显低于NC组，Dex+MIRI+NC组细胞活力和miR-146a mRNA相对表达量高于Dex+MIRI+抑制剂组，而ROS水平表现出相反趋势(均P<0.05)。表明Dex可能通过上调miR-146a表达来增加MIRI损伤大鼠心肌细胞的细胞活力，氧化应激可能参与了这一机制。

表3 各组大鼠心肌细胞miR-146a mRNA、ROS及细胞活力水平比较

2.3 各组大鼠心肌细胞GRP78、CHOP、CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相对表达量比较 见表4。抑制剂组和MIRI+NC组GRP78、CHOP mRNA相对表达量高于NC组，MIRI+NC组低于MIRI+抑制剂组而高于Dex+MIRI+NC组，且Dex+MIRI+抑制剂组高于Dex+MIRI+NC组，而CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相对表达量显示出相反趋势(均P<0.05)。说明Dex可以通过增加miR-146a表达来抑制MIRI损伤大鼠心肌细胞的ERS和氧化应激，MAPK信号通路可能参与了这一机制。

表4 各组大鼠心肌细胞GRP78、CHOP、CAT、MnSOD、NQO1 mRNA相对表达量比较

2.4 p38 MAPK信号通路抑制剂作用下各组大鼠心肌细胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相对表达量比较 见表5。MIRI组细胞活力低于对照组，但在MIRI+SB组和Dex+MIRI组中升高(均P<0.05)。MIRI组GRP78、CHOP mRNA相对表达量高于对照组，MIRI+SB和Dex+MIRI组则低于MIRI组(均P<0.05)。但Dex+MIRI+SB组GRP78 mRNA相对表达量低于Dex+MIRI组，CHOP mRNA相对表达量高于Dex+MIRI组(均P<0.05)。

表5 p38 MAPK信号通路抑制剂作用下各组大鼠心肌细胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相对表达量比较

2.5 miR-146a抑制剂和SB预处理2 h后各组大鼠心肌细胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相对表达量比较 见表6。抑制剂组细胞活力低于NC组，而抑制剂+SB组细胞活力高于抑制剂组(均P<0.05)。抑制剂组CHOP、GRP78 mRNA相对表达量高于NC组和抑制剂+SB组(均P<0.05)。抑制剂+SB组GRP78、CHOP mRNA相对表达量低于抑制剂(均P<0.05)。由此可知，Dex可能会增加miR-146a表达并进一步使MAPK信号通路失活，从而抑制细胞外信号调节激酶活化和ERS，促进MIRI损伤大鼠心肌细胞的细胞活力。

表6 miR-146a抑制剂和SB预处理2 h后各组大鼠心肌细胞活力及CHOP、GRP78 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

临床将患者冠状动脉部分或者完全急性梗阻后于一定时间内重新获得再通时缺血心肌恢复正常灌注但其组织损伤出现加重的病理过程称为心肌缺血后再灌注损伤。该疾病严重影响患者生命健康，甚至会导致其死亡，预防心肌缺血后再灌注损伤的发生是临床一直致力解决的问题。本研究探究了Dex在MIRI损伤大鼠模型中的作用，进一步揭示了miR-146a、ERS、氧化应激和MAPK信号通路是关键调节剂，Dex可以通过这些调节剂调节MIRI损伤大鼠心肌细胞活力或凋亡。因此，在本研究中发现的机制可能是支持性证据，表明Dex在治疗MIRI损伤中的有效性。

Gao等[7]研究发现，Dex可以防止MIRI诱导的心肌细胞损伤和炎症，从而提高细胞存活率。因此，Dex、miR-146a和细胞生长间可能存在联系。本研究发现，MIRI+Dex组细胞活力、SOD活性和miR-146a相对表达量高于MIRI组，LDH活性、MDA水平、GRP78和CHOP表达、细胞凋亡率均低于MIRI组。其中，SOD、MDA和LDH是评价抗氧化系统状态的标志物，而GRP78和CHOP被视为ERS指标[8-9]。提示Dex可能会提高miR-146a，并通过下调MIRI损伤大鼠心肌细胞的氧化应激和ERS，导致细胞活力增加和细胞凋亡率降低。研究[10-12]表明，ERS参与了MIRI进程，抑制ERS可以减轻MIRI对心肌细胞的损伤。还有报道称ERS能够引发氧化应激并破坏线粒体功能，导致CHOP依赖性细胞死亡。研究[13-14]显示，Dex通过抑制NLRC5缺陷小鼠炎症和氧化应激来防止肝脏缺血/再灌注损伤，通过抑制氧化应激和炎症反应来减轻对大鼠大脑的缺血/再灌注损伤。因此，可假设Dex可以提高miR-146a表达，从而下调ERS和氧化应激，导致细胞活力增加和细胞凋亡降低。据报道[15-16]，Dex通过α2-肾上腺素受体依赖性抑制氧化应激来减轻原位肝移植引起的急性肠道损伤。因此，Dex可通过α2-肾上腺素受体刺激MAPK信号通路，从而减轻心肌细胞的MIRI损伤。此外，通过探讨Dex对MIRI损伤大鼠心肌细胞在抑制miR-146a后的影响发现，细胞活力和miR-146a、CAT、MnSOD和NQO1的表达降低，而细胞凋亡率、使用miR-146a 抑制剂和Dex后的ROS水平、GRP78和CHOP表达增加，表明miR-146a在Dex对细胞活力、细胞凋亡、氧化应激和ERS的影响中起关键作用[17-18]。在MIRI损伤大鼠心肌细胞中使用SB与Dex组合不会增加细胞活力，但会进一步降低Dex降低的GRP78和CHOP表达。将SB与miR-146a抑制剂一起使用能够增加被miR-146a抑制剂降低的细胞活力，并且在心肌细胞中GRP78和CHOP表达被miR-146a抑制剂降低。鉴于这些事实，推测Dex可以通过miR-146a影响ERS，从而影响细胞活力，这在一定程度上依赖于MAPK信号通路。

综上所述，Dex可能通过调节miR-146a表达，进一步调节ERS和氧化应激，最终通过MAPK信号通路影响MIRI损伤大鼠心肌细胞的细胞活力和凋亡。然而，这项研究存在一定局限性，由于α2-肾上腺素受体在心室肌细胞中表达不高，在进一步实验之前检测心肌细胞中α2-肾上腺素受体表达可使研究更有说服力。Dex是一种新型的α2-肾上腺素受体激动剂，膜内受体表达的改变会影响Dex的作用，因此应进一步探讨MIRI损伤后受体表达的变化[19]。此外，SB部分逆转了miR-146a抑制剂对细胞活性、GRP78和CHOP的影响[20]。