富血小板血浆和弗林蛋白酶激动剂对大鼠膝骨关节炎的缓解作用实验研究

周安远，梁朝鑫，杨斯淇，吕 沛，杨 帆，杨 彪，吴立蔚，王哲纬，，杨 渊，5

(1.广西医科大学，广西 南宁 530021；2.广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用协同创新中心，广西 南宁 530021；3.广西再生医学重点实验室，广西 南宁 530021；4.广西医科大学附属肿瘤医院，广西 南宁 537003；5.广西医大开元埌东医院，广西 南宁 530028)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是临床上很常见的一种慢性、退行性、顽固性关节疾病，主要是以关节软骨退行性病变、膝关节周围继发性骨质增生和关节滑膜炎症等为临床病理特征[1]。KOA多发于50～60岁人群，是导致其活动困难甚至身体残疾的重要原因。研究[2-3]显示，我国大约1.053亿人患有KOA，有症状KOA患病率约8.1%，并且随着年龄增长而升高，而单侧膝关节置换术总治疗费约3.6万，给患者家庭和社会带来了极大的经济负担。临床上治疗早期KOA常采用口服非甾体抗炎药、膝关节腔注射透明质酸或皮质类固醇药物、功能锻炼、中药热敷、物理疗法等治疗方案。以上方案均有一定的治疗效果，但是对软骨损伤的修复效果作用不大，并且长期疗效不佳[4]。虽然可以采取多种治疗方案，但是临床中控制KOA疼痛的效果依然不是很理想，口服长效药物也会有很大的胃肠道不良反应、心血管意外等风险[5]。采用手术方案时，膝关节修复面积有限，很难解决软骨进行性损伤和退变的根本问题，最终只能选择全关节置换手术[6]。富血小板血浆(Platelet rich plasma，PRP)来自人体外周血，富含大量细胞因子，如转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、人类生长激素(hGH)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及骨形成蛋白(BMP)等，可促进软骨细胞增殖、成软骨分化以及软骨基质合成[7]。大量临床研究[8-9]表明，PRP可有效缓解早期KOA症状，控制疾病进展，改善预后，临床使用PRP治疗KOA已获得国内专家共识。虽然PRP已经在临床上广泛使用，但PRP治疗KOA的分子机制尚不清楚。有研究[10]表明，弗林蛋白酶(Furin)是一种钙依赖性的丝氨酸内切蛋白酶，属于前蛋白转化酶家族，其广泛存在于脊椎动物的细胞中，并通过其酶切作用使无活性蛋白质前体转化为有活性蛋白形式。所以，我们想到用Furin激动剂激活Furin，进而对膝关节软骨细胞起到一个正向作用。因此，本研究通过体内外实验探究PRP和Furin激动剂对SD大鼠KOA的缓解作用，为临床治疗KOA提供支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料 30只8.5周龄雄性SD大鼠和6只2～3 d雄性SD大鼠均购自广西医科大学动物实验中心(许可证号：SYXK桂2020-0004，伦理编号：202105003)。Furin激动剂(批号：AD07025689)购自广西卓一科技有限公司；DMEM培养基(批号：SH30022.01B)购自美国Hyclone公司；胎牛血清(批号：21030704)购自浙江天杭生物科技股份有限公司；0.25%胰蛋白酶(批号：20210717)购自北京索莱宝科技有限公司；Ⅱ型胶原酶(批号：C8150)购自北京索莱宝科技有限公司；脂多糖(LPS，批号：L2630)购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS，批号：SV30087.02)购自美国Hyclone公司；DEPC处理水(批号：C3088)购自德国RUIBIO公司；氯仿(批号：H44020154)购自中国上海国药公司；异丙醇(批号：80109218)购自中国上海沪试公司；无水乙醇(批号：CNNO.32061)购自中国常熟市鸿盛精细化工有限公司；SYBR Green PCR试剂盒(批号：Thermo F-415XL)和反转录试剂盒(批号：Thermo K1622)购自美国赛默飞公司。

1.2 体内实验

1.2.1 大鼠KOA模型制备与分组：30只SD雄性大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射，麻醉满意后将大鼠置于仰卧位并固定于手术台上，常规消毒铺巾。使用备皮刀对大鼠左、右后肢备皮，用纱布蘸取新洁尔灭清洗后肢，用碘伏消毒后肢。实验组(10只)和对照组(模型组，10只)大鼠于左右膝平行膝直韧带内侧做2 cm切口，将皮肤、肌肉和筋膜等依次分离，切开关节囊，屈膝90°将髌骨移位，打开关节腔，找到前交叉韧带并用剪刀离断，进行前抽屉试验以保证前交叉韧带完全离断，0.9%氯化钠溶液冲洗关节腔，缝合关节囊和皮肤。假手术组(10只)只切开关节囊，不做任何处理，最后缝合。待所有大鼠苏醒后放回笼中。

1.2.2 PRP提取与大鼠KOA模型干预：用抗凝管收集各组大鼠外周全血，首先以215 g速度离心10 min。离心结束可见血液分为3层，上层淡黄色清液为血浆层，中间呈白色主要为白细胞、高浓度血小板层，下层深红色部分主要为红细胞层。用注射器插入抗凝管底部吸取红细胞层弃除，然后以863 g速度离心12 min，可见分为血浆层和高浓度血小板白细胞层。弃除上清至初始全血的10%，则为所需PRP。按照PRP∶氯化钙为1∶9的比例加入氯化钙溶液，放进4 ℃冰箱过夜激活，次日可见PRP形成凝胶状，再以1500 r/min离心5 min，见凝胶状物沉淀于底部，上层清液即为被激活后的PRP。将被激活的PRP进行过滤，除去细菌及白细胞后分装至EP管中冻存至-80 ℃冰箱中保存备用。实验组关节腔隔天注射激活后的PRP 0.5 ml，对照组和假手术组关节腔隔天注射0.9%氯化钠溶液0.5 ml，持续4周。

1.2.3 膝关节病理脱钙染色：各组大鼠关节软骨组织脱蜡后常规石蜡包埋切片，做HE染色、番红固绿染色、甲苯胺蓝染色后显微镜拍照取图分析。①石蜡切片：固定新鲜组织24 h以上，取出后置于通风橱内，用眼科剪将目的部位组织修平整后放入脱水盒中。将脱水浸蜡后的组织放入包埋机，包埋完毕后用切片机切片(厚4 μm)，烤干后取出常温保存备用。②HE染色：苏木素染色细胞核3～8 min，PBS水洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。伊红染色细胞质1～3 min。最后将切片依次放入无水乙醇和二甲苯5 min脱水透明，切片晾干后用中性树胶封片。③番红固绿染色：切片放入番红染液中染色1～2 h，流水冲洗去除多余染料。将切片依次放入50%、70%、80%梯度酒精中各3～8 s脱色，再放入固绿染液中染色30～60 s。无水乙醇三缸脱水后，将切片放入干净二甲苯透明5 min，用中性树胶封片。④甲苯胺蓝染色：把切片浸入甲苯胺蓝染液静置5 min，用流水冲洗后以1%冰醋酸稍分化。流水冲洗终止反应后，在显微镜下精确控制其分化程度。再次冲洗，把切片放于烤箱中烘干，用透明中性树胶封片。

1.2.4 膝关节免疫组化染色：石蜡切片脱蜡至水后抗原修复，放入3%过氧化氢溶液，室温下避光孵育25 min。将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上洗涤3～5次，每次5 min，用血清封闭30 min。去掉封闭液，将配好的一抗滴到切片上，然后放入湿盒以4 ℃孵育12 h。将与一抗相应种属的二抗覆盖，室温下孵育50 min。将玻片置于PBS中洗涤3次，每次5 min。滴入DAB显色液，用显微镜调控好显色时间，如果显色为棕黄色即为阳性，流水冲洗切片终止显色。细胞核最后用苏木素染色，脱水封片。检测软骨蛋白聚糖抗体(ADAMTS)-5和白细胞介素-1β(IL-1β)两种相关抗体的表达。

1.3 体外实验

1.3.1 大鼠原代细胞提取与培养：采用过量麻醉药将2～3 d雄性SD大鼠处死，在无菌条件下把其膝关节软骨剥离出，然后用眼科剪把软骨组织块尽量剪碎为1 mm×1 mm×1 mm碎片，加入0.25%胰蛋白酶2 ml置于37 ℃恒温箱消化30～60 min，用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。巴氏吸管轻轻吹打软骨组织碎片悬液，以500 r/min低速离心后吸出上层液体并加入0.2%Ⅱ型胶原酶(用10%胎牛血清DMEM溶解)吹打充分混匀，继续放在37 ℃恒温箱里消化5 h后以1500 r/min离心收集底层软骨细胞，加入等体积DMEM终止消化，吹打混匀后用100 μm滤网过滤掉体积较大的软骨块，获得有软骨细胞的悬浊液。加入适量PBS润洗2～3遍，加入15 ml 10%胎牛血清DMEM，用巴氏吸管转移到T75培养盒中，显微镜下观察软骨细胞密度后放入含5% CO2的37 ℃细胞培养箱。隔天更换新鲜培养基，待细胞长至培养盒90%以上时，按1∶3比例传代，第3代软骨细胞用于后续实验。

1.3.2 PRP与Furin激动剂对LPS软骨细胞模型的干预：将T75培养盒中原有培养液倒去，用PBS漂洗2次，加入0.25%胰酶消化细胞，观察细胞消化情况。待细胞变圆后吸去胰酶，加入10%胎牛血清DMEM培养基，将细胞吹打为单细胞悬液，将细胞混匀。将软骨细胞按一定比例进行分盘，加入适量培养基放入含5% CO2的37 ℃细胞培养箱中。当细胞处于对数期时，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于6孔培养板中，每孔2 ml，过夜培养。待细胞贴壁后，除对照组外，每组给予10 μg/ml的LPS诱导刺激24 h后弃掉培养液，制作软骨细胞损伤模型，然后按组分别给予5% PRP、10% PRP、20% PRP、Furin激动剂(1 mg/ml)作用24 h。24 h后，收集细胞上清，以3000 r/min离心20 min，取上清，待做酶联免疫吸附实验(ELISA)。细胞用TRIzol置于冰上裂解后提取RNA，待做PCR。

1.3.3 ELISA检测相关炎症因子表达：各组软骨细胞培养24 h后，以3000 r/min离心20 min后取上清液，按照ELISA法检测试剂盒说明书检测IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等炎症因子水平。

1.3.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测相关基因mRNA表达：采用TRIzol提取试剂盒抽提细胞内总RNA，采用第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，进行PCR。等待PCR扩增期间，RT-PCR仪可设置为自动分析数据结果，根据阴性对照调整阈值和基线以确定各标本Ct值，并根据熔解曲线确定该Ct值是否有效。导出有效结果后，用2-△△CT法分析目的基因在对照组和各实验组间的表达差异。目的基因包括基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-13、IL-6、ADAMTS-4、ADAMTS-5、IL-1β和环氧化酶(COX)-2、聚蛋白多糖(ACAN)和Ⅱ型胶原A1(COL2A1)。

2 结 果

2.1 各组大鼠膝关节大体观 见图1。对照组膝关节关节面不光滑并且有骨赘增生和炎症浸润。实验组关节面光滑、周围无炎症浸润。假手术组总体无明显变化。

图1 各组大鼠膝关节大体观

2.2 各组大鼠膝关节HE、番红固绿和甲苯胺蓝染色结果 见图2。对照组软骨细胞结构部分被破坏，关节表层粗糙、不连续，部分软骨细胞排列紊乱，可见软骨层有炎症浸润及组织变性、坏死、增殖等。假手术组膝软骨层光滑完整，没有炎症细胞浸润，软骨细胞外基质完整。实验组软骨光滑、完整、连续，软骨细胞大部分都排列整齐，炎症细胞浸润较少，软骨细胞外基质比较完整。

图2 各组大鼠膝关节HE、番红固绿和甲苯胺蓝染色结果(×40)

2.3 各组大鼠膝关节免疫组化染色结果 见图3。本研究中，ADAMTS-5和IL-1β两种抗体均在免疫组化染色中有阳性表现。

2.4 SD大鼠软骨细胞经不同处理后相关炎症因子浓度变化 见图4。ELISA结果显示，加入LPS后，IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS浓度显著增加(均P<0.05)。加入不同浓度PRP后，各炎症因子浓度随着PRP浓度的增加呈下降趋势(均P<0.05)。加入Furin激动剂后，各炎症因子浓度亦有所下降(均P<0.05)。

2.5 SD大鼠软骨细胞经不同处理后相关基因表达变化 见图5。RT-PCR结果显示，加入LPS后，MMP-3、MMP-13、IL-6、ADAMTS-4、ADAMTS-5、IL-1β和COX-2的mRNA表达增加，ACAN和COL2A1的mRNA表达下降(均P<0.05)。加入不同浓度PRP和Furin激动剂后，上述指标有所修复。

图5 SD大鼠软骨细胞经5种不同处理后9种相关基因表达变化注：各图横坐标中，A为SD大鼠软骨细胞，B为SD大鼠软骨细胞+LPS，C为SD大鼠软骨细胞+LPS+5% PRP，D为SD大鼠软骨细胞+LPS+10% PRP，E为SD大鼠软骨细胞+LPS+20% PRP，F为SD大鼠软骨细胞+LPS+Furin激动剂。与A比较，*P<0.05，△P<0.01；与B比较，#P<0.05，▲P<0.01

3 讨 论

KOA在临床骨科中属于常见的软骨退行性疾病，膝关节软骨进行性退化和关节周围组织炎症是其主要的病理特征[11]。KOA好发于中老年人群，其关键的临床症状是疼痛、肿胀、限制性活动等。KOA的发病基础是关节软骨基质合成与分解的失衡。所以，治疗KOA的关键还是要促进关节软骨修复，调节软骨基质的平衡[12]。如今大部分的KOA患者都采取保守治疗方案，如透明质酸和糖皮质激素等药物关节内注射[13]。近年来，医疗和科研工作者通过共同努力给我们带来的PRP疗法起到相当好的作用，并且经济，无免疫排斥反应，但是其中的具体机制研究不是很完善。Wu等[14]通过进行PRP对新西兰大白兔软骨细胞活力影响的基础性研究，推测PRP可能抑制了Wnt/β-catenin信号转导通路，从而激活软骨细胞增殖与抑制软骨细胞炎性反应和退行性病变。PRP在激活以后,主要释放一些如白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、肿瘤坏死因子受体(TNF-R)Ⅰ和Ⅱ等抗炎因子，IL-1RA可通过阻滞IL-1R抑制IL-1活化，TNF-R Ⅰ、Ⅱ可通过与TNF-α结合而阻止与之相关的信号通路的传导[15]。本研究探讨了PRP和Furin激动剂对LPS诱导的关节软骨细胞损伤和大鼠骨关节的保护作用，结果表明PRP和Furin激动剂均可以有效地缓解KOA的发展。

PRP是自身全血经过两次高速离心萃取来的高浓度血小板，最终提取的PRP血小板浓度是全血血小板浓度的3～5倍。PRP在机体内可发挥重要作用，主要是由于其含有大量血小板生长因子、少量白细胞和纤维蛋白，它们共同发挥最佳的软骨再生、修复和对炎症因子清除的作用[16]。到目前为止，PRP的制备主要受到其提取手法、保存方式、激活时间等多种不同因素的影响，其标准很难统一，造成不同制备方法间PRP收集浓度有所差异，从而导致临床疗效不一致。研究发现，二次差速离心方法能为临床应用提供质量最佳的PRP。Veronesi等[17]研究发现，新鲜提出的PRP比冷冻后储存后的PRP更有优势。血小板的体积问题也会影响到其活性，如果血小板自身体积比较大则可以含有更多α颗粒，所以其生物活性与反应能力都是更强的。而且血小板最适浓度、其中白细胞和红细胞含量都会对疗效有不同程度的影响[18]。也有研究[19]显示PRP可能会对年轻人或者关节病理侵害轻的患者有较好的治疗效果。因此，很多因素都可以影响PRP质量，这恰恰也是临床疗效产生差异性的关键问题。

Furin作用底物丰富，包括信号肽、细菌毒素和病毒融合肽、生长因子、离子通道、激素、跨膜受体、细胞外基质蛋白和血清蛋白等[20]。而Furin激动剂可以激活体内的Furin，使之参与体内多种生物活动的调节，所以我们用的Furin激动剂在骨关节炎中对维持软骨内环境稳态及代谢有重要意义。在我们的研究中PRP和Furin激动剂作用于SD大鼠KOA，通过体内外实验共同验证它们对关节软骨的正向修复作用，进而缓解KOA病程的发展。

综上所述，PRP和Furin激动剂对SD大鼠KOA均有明显的缓解作用。但本研究也存在不足之处，对于其中治疗机制的验证手段不是很充分，PRP的制备方法也没采用统一标准，后续将加以完善，继续更深层次的研究。