SD大鼠生育力与早期胚胎发育毒性试验背景数据的建立

杨 阳，崇立明，姜 娟，王 蓉，许 丽，马爱翠，骆永伟，贾玉玲，周 莉，孙祖越

（1.上海市生物医药技术研究院，中国生育调节药物毒理检测中心，上海 200032；2.湖北天勤生物科技有限公司安评中心，湖北 武汉 430000）

药物生殖毒性试验是药物非临床安全性评价的重要内容，是药物进入临床及上市的重要环节。其中生育力与早期胚胎发育毒性试验（即Ⅰ段生殖毒性试验）是观察药物对亲代动物配子形成、交配行为、生育力、胚胎着床前及着床后生长发育的影响。根据人用药物注册技术要求国际协调会（Inter⁃national Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）（S5）［1］和国家食品药品监督管理总局［2］的指导原则，该研究推荐的啮齿类动物为大鼠，但由于大鼠品系、个体差异、来源、实验室条件和测定方法及测量仪器不同等因素，其生物学数据有一定的差异。为使实验数据的解释更加客观、可靠、准确，本文对本研究室2012-2019年完成的10项SD大鼠生育力与早期胚胎发育毒性试验中溶媒对照组的数据〔共计484只SD大鼠（雌雄各半）、228只交配成功的雄性SD大鼠和219只妊娠大鼠的相关指标〕进行统计分析，初步建立了本研究室SD大鼠生育力与早期胚胎发育毒性指标的背景数据，为药物生殖毒性安全性评价的开展和结果判断提供重要数据支持。

1 材料与方法

1.1 动物、饲料和仪器

SD大鼠，雄性5～8周龄，雌性7～9周龄，SPF级，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2008-0016、SCXK（沪）2013-0016和SCXK（沪）2018-0006。大鼠均来自同一供应商，供应商采用封闭群的繁殖方法（即循环交配法），因而可以保持群体动物基因的杂合性和基因频率的稳定性。大鼠饲养在上海市计划生育科学研究所（中国生育调节药物毒理检测中心）SPF级小动物房，动物使用许可证号：SYXK（沪）2008-0027、SYXK（沪）2013-0027和SYXK（沪）2018-0017。室温20～26℃，相对湿度40%～70%，光照7∶00～19∶00；每笼4～5只，自由饮水、摄食，试验开始前大鼠适应性饲养5 d。繁殖鼠料（高压蒸汽灭菌），上海仕林生物科技有限公司。PL2002电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；YC-2型程控电刺激器，成都仪器厂；TOX IVOS计算机辅助精子分析仪，美国Hamilton Thorne公司。

1.2 试验方法

回顾性分析本研究室完成的10项SD大鼠生育力与早期胚胎发育毒性试验，溶媒对照组（纯水）共计484只SD大鼠，雌雄各半；交配后共有228对交配成功，最终219只雌性大鼠成功妊娠。交配前，雌性大鼠连续ig给予纯水2周，雄性大鼠连续ig给予纯水9周。然后按1∶1合笼交配，连续交配2周。交配期每天上午进行阴道涂片检查，查到精子或阴栓当日定为妊娠第0天（the gestation 0 day，GD0）；雌性大鼠连续ig给予纯水至GD7，于GD14处死并检测相关指标；雄性大鼠连续ig给予纯水至交配成功，当日处死并检测相关指标。2周内未交配成功的雌、雄大鼠停止给予纯水，处死并检测相关指标，不纳入数据汇总。

1.3 分析指标

1.3.1 交配前SD大鼠

①体重：每周2次。②摄食量：每周1次。

1.3.2 交配成功后雄性SD大鼠

①脏器：取睾丸、附睾、包皮腺、前列腺、精囊腺、提肛肌和括约肌称重，计算脏器系数〔脏器重量（g）/体重（g）×100〕。②生育力：交配率、勃起潜伏期（电刺激法）、交配成功时间；附睾尾精子数量及运动功能，包括活动率、平均路径速度、直线运动速度、曲线运动速度、精子头侧摆幅度、鞭打频率、前向性和直线性。

1.3.3 妊娠大鼠

①体重：GD0，GD3，GD7，GD10和 GD14测量体重；宫外增重（GD14体重-GD0体重-胎重）。②早期胚胎发育：记录胎重（连子宫）、黄体数、活胎数、死胎数和吸收胎数，计算着床数、活胎率、死胎率、吸收胎率和着床前丢失率。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 交配前SD大鼠体重和摄食量

交配前SD大鼠体重和摄食量及其95%CI和CV分别见表1和表2，可见雄性和雌性大鼠体重和摄食量随时间的增加而稳定增加。

Tab.1 Body mass of SD rats before mating

Tab.2 Food consumption of SD rats before mating

2.2 交配成功后雄性SD大鼠附属生殖脏器重量和系数

228只雄性SD大鼠交配成功后处死，取附属生殖脏器睾丸和附睾等称重，计算脏器系数，并计算它们的95%CI和CV。结果见表3。

Tab.3 Accessory reproductive organ mass and coefficient of successfully mated male SD rats

2.3 交配成功后雄性SD大鼠生育力指标

242只雄性SD大鼠共有228只交配成功，交配率为94.2%，交配成功时间为（2.6±1.5）d，95%CI为2.4～2.8 d，CV为58.5%。雄性SD大鼠交配成功后，当天采用电刺激法进行阴茎勃起潜伏期检测，潜伏期为（20.3±3.2）s，95%CI为19.9～20.7 s，CV为15.7%。对雄性SD大鼠附睾进行精子分析，精子数量为（95.1±87.5）×106·g-1附睾，95%CI为（83.7～106.5）×106g-1附睾，CV为92.0%；活动率为（56.5±18.8）%，95%CI为 54.0%～58.9%，CV 为33.3%（表4）。

Tab.4 Fertility of successfully mated male SD rats

2.4 妊娠SD大鼠妊娠期体重和宫外增重

GD14剖检显示，228只交配成功雌性大鼠中，共有219只成功妊娠，妊娠率为96.1%。妊娠期体重随妊娠时间的增加而稳定增加（表5），宫外增重为（55.2±9.7）g。

Tab.5 Body mass of pregnant rats after successful mating

2.5 妊娠SD大鼠早期胚胎发育指标

于GD14处死妊娠SD大鼠，取出子宫和黄体，称量胎重，计数黄体数、着床数和吸收胎数等指标。结果显示，219只妊娠大鼠黄体总数为2895个，着床数为2781个；活胎数为2637只，死胎数为8只（分布于8只妊娠大鼠），吸收胎数为136只（分布于101只妊娠大鼠）（表6）。

Tab.6 Early embryonic development of pregnant rats

3 讨论

在药物开发过程中，生殖毒性研究的目的是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其对生殖细胞及动物妊娠、分娩和哺乳等亲代生殖功能可能产生的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育和出生后发育的不良影响，其中生育力与早期胚胎发育毒性试验（即Ⅰ段）是在SD大鼠由交配前到交配期直至胚胎着床期给药，观察其对亲代配子形成、交配行为、生育力、胚胎着床前及着床后生长发育的影响，评价其对大鼠的生殖毒性，为临床试验提供参考。

生育力与早期胚胎发育毒性试验中，体重和摄食量的异常会直接影响后续的交配行为，可以提供最直接和清晰的关于药物毒性的评价。在本研究室雄性和雌性大鼠交配前持续给药9周和2周，每周称量体重2次，24 h摄食1次。交配前雄性SD大鼠前期体重CV偏大，是由于不同批次购买大鼠周龄有差异，导致给药时初始体重相差较大。根据《药物生殖毒性研究技术指导原则》要求，选用年轻、性成熟的成年动物，个体动物初始体重不应超出平均体重±20%。本实验室在单批次试验中均满足该条件。随着时间的增加，动物体重增长减缓，CV变小，摄食量的变化与体重增长减缓有一定的相关性。雌性SD大鼠体重和摄食量随着时间的增长而增加，CV均较小。这与朱华等［3］报道“随着年龄增长，动物体重平稳增加，雄性动物的增长幅度大于雌性”的结论相一致。

雄性SD大鼠在交配成功后，进行生育力检测和解剖取材。通常要求对睾丸和附睾称量，计算脏器系数。本研究室增加了对附属生殖脏器如包皮腺、前列腺和精囊腺等的称重，其中包皮腺CV较大，由于包皮腺取材较困难，人为因素影响较大，提示实验中应由熟练的技术人员操作。生育力检测结果显示，交配率为94.2%，交配成功时间（2.6±1.5）d，这与叶向锋等［4］报道相吻合。本研究采用计算机辅助精子分析仪检测附睾尾精子的运动能力。结果显示，雄性大鼠精子活动率为（56.5±18.8）%，与宋翼升等［5］研究结果〔活动率（58.3±6.8）%〕基本一致，其他指标如平均路径速度、直线运动速度和曲线运动速度等也基本接近。

妊娠大鼠体重变化是评价受试物对母体毒性的一个重要指标。本研究室妊娠大鼠GD0体重为（229±17）g，GD14为（295±19）g，体重随妊娠期延长而增加，CV较小，生长发育良好。黄体数、着床数和活胎数等指标是衡量早期胚胎发育毒性的重要指标。本研究室雌性大鼠妊娠率为96.1%，平均黄体数为（13.2±1.7）个，平均着床数为（12.7±1.9）个，平均活胎数为（12.0±2.1）只，活胎率为94.8%。由于现有文献缺乏相关的背景数据，通过与其他机构发表的案例比较，各研究机构妊娠大鼠平均黄体数、着床数和活胎数等指标相差较小［6-8］。国外学者研究报道，Wistar大鼠妊娠率为94.0%，平均黄体数为（13.3±2.1）个，平均着床数为（12.0±2.3）个，平均活胎数为（11.0±2.4）只，活胎率为93.0%［9］，本实验室数据与此略有差别，可能与动物种属不同有关。

本研究为本研究室近几年来不同批次生殖毒性研究数据的积累，随着研究的开展，后续还会补充更多的数据，进行动态研究汇总。希望这些背景数据可为受试物生殖毒性评价提供重要支撑，使评价结果更加科学、合理并贴合实际。