2种小鼠应激模型致模式分离损伤特点及米非司酮和普萘洛尔对足底电击模型小鼠模式分离的干预作用比较

王 昊，王子元，黄 晏，周文霞

（军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

记忆是指大脑编码、存储和提取信息的能力，而记忆准确性是大脑辨别相似记忆的能力。记忆准确性的神经生物学机制为模式分离（pattern sep⁃aration）［1-2］，其过程是一种将重叠或相似记忆表征转化成独立且互不干扰的记忆表征的认知过程，其中时间与空间的模式分离在保持记忆准确性过程中发挥主要作用［3-4］。应激是很多疾病的重要诱因［5-6］。过度应激可损伤人及动物的记忆准确性，主要表现为时间及空间模式分离能力的降低［7-8］。研究还发现，创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）患者模式分离能力显著低于正常人，导致其无法有效区分安全环境与威胁环境，提示PTSD患者记忆准确性明显下降［9-10］。然而，不同应激方式或范式损害模式分离的特点尚不十分清楚。因此，比较不同应激条件下模式分离损伤的特点对于阐明应激损伤记忆准确性的机制并开展防治研究具有重要意义。

应激能够引起糖皮质激素和肾上腺素释放增加，造成学习记忆能力降低［11］，但糖皮质激素和肾上腺素在应激所致记忆准确性降低中的作用尚不清楚。米非司酮（mifepristone）是糖皮质激素受体拮抗剂，能够在一定程度上改善慢性不可预知应激导致的学习记忆损伤［12］以及慢性应激导致的神经发生减少［13］。普萘洛尔（propranolol）是一种非选择性β1和β2肾上腺素受体阻滞剂，能够促进应激后恐惧记忆的消退［14］，改善PTSD症状［15］，并缓解应激导致的焦虑、抑郁和识别记忆能力降低等行为［16］。目前，米非司酮与普萘洛尔对应激致模式分离损伤的影响及特点尚不明确。因此，观察并比较米非司酮与普萘洛尔影响时间和空间模式分离损伤的特点，对阐明糖皮质激素和肾上腺素在应激致记忆准确性障碍中的作用特点具有重要意义。

本研究首先比较了足底电击和sc给予皮质酮2种应激方式对时间和空间模式分离影响的动态变化特点；然后，采用足底电击模型观察米非司酮和普萘洛尔对应激致模式分离损伤的作用，并比较两药在改善时间和空间模式分离方面的差异。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重20～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。动物饲养环境温度为21～25℃，湿度为45%～55%，自由摄取食物和饮水，每日光照/黑暗各12 h（光照时间7∶00-19∶00），小鼠进实验室适应性饲养5～7 d后开始实验。所有动物实验遵循军事医学研究院动物实验伦理委员会规定。

1.2 试剂和主要仪器

皮质酮，上海梯希爱化成工业发展有限公司，使用10%无水乙醇配成混悬液。米非司酮，上海陶素生化科技有限公司，使用生理盐水配成混悬液。普萘洛尔，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，使用生理盐水配成溶液。

ANY-maze动物视频分析系统，美国Stoelting公司；自主活动测试实验装置（30 cm×30 cm×30 cm），上海吉量软件科技有限公司；物体识别实验箱（圆柱形，乳白色亚克力材质；外径：450 mm，内径：440 mm，高度：410 mm，壁厚：5 mm）和电击箱（52cm×30cm×55cm），上海欣软信息科技有限公司。

1.3 空间模式分离位置选择

采用19只小鼠进行空间模式分离位置选择实验。实验分为学习期（T1）和测试期（T2）2个阶段。取物体识别实验箱中央两端距箱壁约13 cm的对称位置为位置1（记为O和O′，相距18 cm），以O′为交点，在垂直于直径的直线上间隔4 cm依次选取4个不同位置，即位置2～5（图1A）。T1：在位置1处放置2个相同的黑色正方锥形物体，将小鼠放入物体识别实验箱，使其自由探索7 min，分别记录小鼠探索2个物体的时间。T2：O处的物体保持不变，将O′处的物体分别移动至位置1，位置3和位置5，再次将小鼠放入物体识别实验箱7 min，分别记录小鼠探索2个不同位置处物体的时间，以小鼠探索位于新位置物体的时间与探索两物体的总时间的比值表征小鼠对新位置的辨别水平。以此评价小鼠对不同位置的辨别水平，以选取合适的位置进行空间模式分离评价。

1.4 足底电击和皮质酮注射应激模型的制备

流程如图1B所示。小鼠适应性饲养结束后进行自主活动测试，实验前将动物放入实验房间适应环境30 min，通过ANY-maze软件与视频采集系统记录小鼠在自主活动箱内20 min的自发活动总距离；每只小鼠测试完毕后，用稀释后的乙醇擦拭箱体，避免气味干扰。以20 min内的活动总距离作为小鼠的自主活动性指标，依据体重和自主活动性均衡分组。

足底电击应激实验分为正常对照组和足底电击组，分组后次日开始电击。电击前，将小鼠放入实验房间适应30 min，再放入电击箱适应5 min，然后开始电击（电流强度1.0 mA，持续6 s，间隔15 s，电击10次，连续3 d）。正常对照组小鼠放入电击箱中同等时间，但不给予电击。

皮质酮注射应激实验分为正常对照组（10%乙醇溶液，sc）和皮质酮（50和100 mg·kg-1，sc）组，连续给药3 d。

1.5 物体识别范式评价时间和空间模式分离

建模后第1，8和15天采用物体识别范式评价时间和空间模式分离。

时间模式分离参照文献［17-18］进行，实验流程如图1C所示。实验分为学习期（分为3个阶段）与测试期。学习期：第1阶段，将小鼠放入物体识别实验箱内适应5 min，然后在箱内位置O与O′处放入2个相同的物体A（黑色，实体正方锥），将小鼠置于2个物体中间位置，面朝箱壁，令其自由探索5 min后取出；第2阶段，将物体A置换为物体B（黑色，玻璃锥形瓶），在同样位置放入小鼠5 min后取出；第3阶段，将物体B置换为物体C（透明色圆柱瓶，内装垫料），在同样位置放入小鼠5 min后取出。测试期：在箱体内放入物体A和物体C，在同样位置放入小鼠，观察5 min内其累计探索物体A和物体C的时间（tA和tC），剔除tA+tC≤5 s的实验动物数据。用时间辨别指数（temporal discrimination index，TDI）表示小鼠的时间模式分离水平，TDI=tA/（tA+tC）。

Fig.1 Flow chart of model building and experimental paradigms of temporal and spatial pattern separation.In positionchoosing experiments，O and O′represent two symmetrical positions 1，the two adjacent positions are 4 cm apart（A）.The mice were accustomed to the environment and experimenter for 7 days before being divided into two groups according to weight and locomotor activity，i.e.control group and stress group.Foot-shock（1.0 mA，each lasting 6 s，at 15 s intervals，and repeated 15 times per day for 3 d）or corticosterone（50 and 100 mg·kg-1，sc，once per day for 3 d）were adopted as two modeling conditions，temporal and spatial pattern separation was evaluated by object recognition paradigm on 1st，8th，15thday after modeling（B）.In the temporal pattern separation paradigm，the mice learned to identify three different groups of objects（object A，B and C）at a 5-min interval in the study phase，the mice had to discriminate object A and C in the test phase（C）.In the spatial pattern separation paradigm，the mice were put into the apparatus with two identical objects located in position 1 in the study phase，the mice were required to recognize the moved object in the test phase（D）.Mice were ig administered with mifepristone（Mife，70 mg·kg-1），propranolol（Prop，20 mg·kg-1）or both 30 min before each stress for 3 consecutive days before they were tested the next day（E）.

空间模式分离参照文献［19-20］进行，实验流程如图1D所示。实验过程分为学习期和测试期。学习期：在箱体中央两端距箱壁约13 cm的对称位置（位置1）放入2个相同物体A和B（黑色，实体正方锥），将小鼠从2个物体中间位置放入，面朝箱壁，小鼠探索7 min后取出。测试期（学习后1 h）：将箱中的B物体换成另一物体（物体C），并放置在与位置1相距较远的位置4，物体A位置保持不变，以同样方式放入小鼠，并观察7 min内tA和tC，剔除tA+tC≤7 s的实验动物数据。用空间辨别指数（spatial discrimi⁃nation index，SDI）表示小鼠的空间模式分离水平，SDI=tC/（tA+tC）。

当小鼠面向物体，用鼻嗅探物体或靠近物体周围2 cm范围内即视为小鼠探索物体行为（用Any⁃maze软件观察记录）。每只小鼠结束探索后，用稀释的乙醇擦拭箱体和物体，以消除前一只小鼠留下的排泄物与气味干扰。

1.6 米非司酮和普萘洛尔干预足底电击致小鼠模式分离损伤实验

实验分为5组：正常对照组、足底电击组、足底电击+米非司酮（70 mg·kg-1）组、足底电击+普萘洛尔（20 mg·kg-1）组和足底电击+米非司酮（70 mg·kg-1）+普萘洛尔（20 mg·kg-1）组，每组8～11只小鼠。给药组于每次电击前30 min ip给药，正常对照组和足底电击组ip给予生理盐水。米非司酮和普萘洛尔给药剂量分别参照文献［21］和文献［22］进行。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠对不同空间位置的辨别水平

实验结果显示，小鼠对位置1的辨别水平与机会水平无显著差异（图2A和B），对位置3和5的辨别水平显著高于机会水平（P<0.05，图2D和2F），提示小鼠对位置3与5的辨别能力非随机选择。与位置1比较，小鼠对位置3的辨别水平有升高趋势（P=0.0866），对位置5的辨别水平显著升高（P<0.01），提示小鼠对位置3有一定辨别能力，能显著辨别位置5（图2G），因此在本研究中选用位置3与5的中间位置4进行空间模式分离能力评价。

Fig.2 Spatial discrimination indexes of mice to different positions.In the study phase(T1),the mice were put into the apparatus with two identical objects located in position 1;in the test phase(T2),position 1 remained unchanged,position 3 moved slightly and position 5 moved significantly.In T1,object A was on the left and object C was on the right.In T2,object C refers to the moved object compared with that in T1.Spatial discrimination index=time exploring object C/(time exploring object A+time exploring object C).±s,n=16-19;＊P<0.05,compared with chance level(chance level=0.5);##P<0.01,compared with the performance in position 1 of mice.

2.2 足底电击对小鼠模式分离的影响

实验结果显示，与正常对照组相比，造模后第1天，足底电击组小鼠的时间（图3A）和空间（图3B）辨别指数均显著降低（P<0.05）；第8天，足底电击组小鼠的空间辨别指数仍显著降低（P<0.01）；第15天，足底电击组小鼠的时间与空间辨别指数与正常对照组相比均无明显差异，提示足底电击应激对时间和空间模式分离均有损伤作用，对空间模式分离的损伤持续时间长于对时间模式分离的损伤。

Fig.3 Effect of foot-shock on pattern separation.See Fig.1B for the mouse treatment.±s,n=13-15;＊P<0.05,＊＊P<0.01,compared with normal control group.

2.3 皮质酮注射对小鼠模式分离的影响

实验结果显示，与正常对照组相比，造模后第1天，2个外源性皮质酮注射组小鼠的时间辨别指数无明显变化（图4A），空间辨别指数均显著降低（P<0.05，图4B）；第8和15天，时间和空间辨别指数与正常对照组比较均无明显差异，提示外源性皮质酮注射仅在造模后第1天对空间模式分离有明显损伤，造模后第8和15天，时间与空间模式分离均恢复正常。

Fig.4 Effect of exogenous corticosterone injection on pattern separation.See Fig.1B for the mouse treatment.±s，n=8-11.＊P<0.05，compared with normal control group.

2.4 米非司酮和普萘洛尔对足底电击致小鼠模式分离损伤的影响

实验结果（图5）显示，与正常对照组相比，足底电击组小鼠的时间辨别指数显著降低（P<0.05），与足底电击组比较，普萘洛尔以及二者联合使用有显著改善作用（P<0.05，图5A）；足底电击组小鼠的空间辨别指数显著降低，米非司酮以及二者联合给药具有显著改善作用（P<0.05，图5B），提示米非司酮与普萘洛尔对应激所致时间和空间模式分离损伤的改善作用不同，联合使用对二者均有改善作用。

Fig.5 Effect of Mife and Prop on pattern separation deficit of mice caused by foot-shock.See Fig.1E for the mouse treatment.±s，n=8-11.＊P<0.05，compared with normal control group，#P<0.05，compared with foot-shock group.

3 讨论

记忆指个人亲身经历的、发生在一定时间和地点的事件信息［23］，包含相关的时间和空间环境信息，而后者涉及记忆的准确性。使用PubMed数据库将“memory”一词与“accuracy”，“precision”，“specificity”，“vividness”，“detail”，“resolution”，“fidelity”等单词联合检索，发现2012-2022年已有大量文献对记忆准确性进行了研究。记忆准确性包含时间与空间模式分离过程，针对这2个方面，本研究采用了VanGoethem等［8，19］的空间模式分离评价范式，首先探索了小鼠对不同空间位置的辨别水平，随着2个物体空间位置距离变大，小鼠对新位置的辨别指数表现逐渐提高，与文献报道的趋势一致［8，20］，选用位置4作为空间模式分离评价的位置；时间模式分离评价采用Kannangara等［17］的评价范式。此2种评价范式操作简单，易于实现，主要原理是依赖动物对新位置的识别能力以及对新物体的偏好，可在没有任何奖励或者惩罚的条件下实现海马驱动的模式分离过程。

模式分离作为记忆准确性的基础，极易受到应激的影响。通过PubMed仅检索到睡眠剥夺［8］、足底电击［24］、神经病理性疼痛［25］3篇2012-2022年发表的应激致模式分离损伤模型文章，但是应激影响不同类型模式分离的特点尚不清楚。小鼠sc给予皮质酮50 mg·kg-1对血清皮质酮水平［26］的升高幅度与足底电击［27］和束缚应激［28］后一致，对一般学习记忆行为的影响也与2种应激的影响相似，因此本研究选用足底电击与外源性皮质酮注射这2种方式模拟应激。本研究基于这2个模型观察并比较了2种小鼠应激模型下模式分离损伤的特点。结果表明，足底电击应激对时间和空间模式分离均有明显损伤作用，但对空间模式分离损伤作用时间更长，与文献［25］报道的足底电击即可造成小鼠模式分离能力损伤结果一致。外源性皮质酮注射模型中，2个剂量的皮质酮对时间模式分离无明显影响，但能够明显损伤小鼠的空间模式分离。比较足底电击和外源性皮质酮注射这2种应激模型损伤模式分离的特点，2种模型的相似之处在于对空间模式分离损伤的持续时间更长。这种不一致现象可能与调控时间和空间模式分离的脑区不同相关，空间模式分离主要受海马齿状回调控，而时间模式分离主要受海马CA1脑区调控［17］；与CA1相比，齿状回的局部环路活动与突触可塑性对应激刺激更为敏感［29］。2种模型的不同之处主要有2点：首先，外源性皮质酮注射应激对时间模式分离无明显影响，仅对空间模式分离有明显损伤作用；其次，皮质酮影响空间模式分离的时长比足底电击模型短。外源性皮质酮注射模型的损伤强度低于足底电击模型，这种现象可能是由外源性皮质酮受血脑屏障渗透性的影响造成的［30］，足底电击应激更适用于制备记忆准确性损伤模型。上述结果提示，应激后高水平糖皮质激素可能是引起空间模式分离损伤的主要因素，而高水平肾上腺素可能是引起时间模式分离损伤的主要因素。

为进一步验证糖皮质激素和肾上腺素对空间模式分离和时间模式分离的影响，本研究基于足底电击模型观察了米非司酮和普萘洛尔对空间和时间模式分离的影响。结果发现，米非司酮对空间模式分离有明显改善作用，而普萘洛尔对时间模式分离有明显改善作用，提示二者改善模式分离损伤的侧重点并不相同，但二者联合使用对时间和空间模式分离损伤均有改善作用。与2种应激模型对空间模式分离损伤作用更强的现象一致，米非司酮对空间模式分离有明显改善作用，可能与调控空间模式分离的齿状回脑区更易受应激影响有关。有研究表明，普萘洛尔能够通过增加海马CA1区热休克蛋白70的表达缓解创伤致脑损伤模型小鼠的认知记忆损伤［31］。因此推测，普萘洛尔对时间模式分离有更好的改善作用，可能与其能够降低CA1区神经元凋亡有关。上述结果进一步证明了糖皮质激素与肾上腺素在空间和时间模式分离中虽有作用，但作用的侧重点并不相同。

综上所述，本研究发现，糖皮质激素水平升高主要造成空间模式分离损伤，而肾上腺素水平升高主要造成时间模式分离损伤，提示应激后不同应激激素对记忆准确性的作用存在差异，为进一步研究应激致记忆准确性损伤的机制以及相关防治药物发现奠定了良好的基础，对于拓展米非司酮和普萘洛尔的临床应用和使用限制也具有一定意义。