三种抗双链DNA抗体检测方法在系统性红斑狼疮诊断中的效能评价

毕 胜，朱红艳，余亚玲，沈燕迪，李文润

(云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院 1.检验科 2.肾内科，云南 昆明 650032)

抗双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)抗体是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)标志性抗体，美国风湿病学会已将其列为SLE的诊断标准之一，同时抗dsDNA抗体滴度与疾病的活动及肾脏受累相关，临床用于监测病情活动和疗效。因此，抗dsDNA抗体的检测是否准确可靠对于临床医生诊疗SLE非常重要。临床检测抗dsDNA抗体比较常用的有间接免疫荧光法(indirect immunofluorescent assay，IIFA)、免疫印迹法(immunoassay，LIA)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和化学发光法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)等，本研究比较IIFA，LIA和ELISA三种方法的分析性能，评价最佳检测方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本收集

收集2017年9月-2018年4月在云南省第一人民医院就诊并确诊为SLE的患者血清93份，其中，男性患者8例，女性患者85例，年龄8～69岁，平均年龄29.5岁。同时收集同时段其他自身免疫性疾病患者的血清标本84份(类风湿性关节炎55例，皮肌炎10例，混合结缔组织病5例，强直性脊柱炎5例，干燥综合征4例，血管炎3例，系统性硬化症2例)作为疾病对照组，其中男性患者26例，女性患者58例，年龄18～78岁，平均年龄48.3岁。收集排除患自身免疫性疾病的健康体检者的血清标本50份作为正常对照组，其中男15例，女35例，年龄23～48岁，平均年龄32.6岁。入组患者的疾病诊断标准均符合国内或国际相关疾病的诊疗标准或指南。

1.2 试剂与仪器

抗dsDNA抗体IgG检测试剂盒(间接免疫荧光法)，抗核抗体谱(IgG)检测试剂盒(免疫印迹法)，抗dsDNA抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)，3种试剂均购同一公司。设备主要是Leica荧光显微镜DM3000，全自动免疫印迹仪EUROBlot Master44，酶标测试仪KHB ST-360。

1.3 方法

3种方法均严格按照试剂盒说明书操作，结果判定：IIFA法用Leica荧光显微镜在40×下观察基质片中绿蝇短膜虫的动基体发出荧光为阳性；LIA法是在抗dsDNA抗原的膜条位置出现显色反应则为阳性；ELISA法为定量检测法，分别以3份标准品的浓度和吸光度为横、纵坐标作标准曲线，并根据标准曲线求出患者样本中抗dsDNA抗体的浓度，浓度≥100IU/mL为阳性。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 抗dsDNA抗体的检测结果

在SLE患者组中，抗dsDNA抗体检测阳性率最高的是ELISA法(60.2%)，其次为LIA法(46.2%)，最低的为IIFA法(38.7%)，均显著高于对照组，差异有统计学意义(P=0.012)，见表1。

表1 3种方法检测抗dsDNA抗体阳性率比较[n(%)]

2.2 3种方法的性能分析比较

以临床诊断为标准，计算3种抗dsDNA抗体检测方法的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值，见表2。ELISA法敏感度和阴性预测值最高(60.2%，77.7%)，IIFA法特异性和阳性预测值最高(99.3%，97.3%)

表2 3种方法检测抗dsDNA抗体的评价指标(%)

2.3 诊断价值

采用ROC曲线分析IIFA、LIA和ELISA 3种方法检测抗dsDNA抗体在诊断SLE中的价值，见图1。曲线下面积(area under the curve，AUC)ELISA是0.782，LIA是0.724，IIFA是0.690，说明ELISA法检测抗dsDNA抗体诊断价值最高。

图1 3种检测方法ROC曲线

2.4 3种检测方法的一致性分析

IIFA方法和LIA方法诊断结果一致性较好(Kappa=0.881，P<0.001)；IIFA诊断阳性率为16.3%，明显低于LIA诊断(19.8%)，且差别具有统计学意义(P=0.008)。IIFA方法和ELISA方法诊断结果一致性一般(Kappa=0.693，P<0.001)；IIFA诊断阳性率明显低于ELISA诊断(26.9%)，且差别具有统计学意义(P<0.001)。LIA方法和ELISA方法诊断结果一致性较好(Kappa=0.804，P<0.001)；LIA诊断阳性率明显低于ELISA诊断(26.9%)，且差别具有统计学意义(P<0.001)。

3 讨 论

抗DNA抗体的靶抗原为DNA双螺旋结构，反应位点位于DNA的脱氧磷酸框架上，抗DNA抗体分为抗dsDNA抗体和抗ssDNA(single-stranded DNA，ssDNA)抗体。抗dsDNA抗体主要见于SLE患者，也偶尔见于其他自身免疫性疾病、感染性疾病，极少数情况见于健康人。抗dsDNA抗体是反应SLE疾病活动较理想的一个指标[1，2]。根据抗dsDNA抗体检测的方法及疾病的进展阶段不同，抗体的阳性率达到20～90%[3]，本研究中SLE组IIFA、LIA和ELISA法检出阳性率分别是38.7%、46.2%和60.2%。

目前临床上检测抗dsDNA抗体的方法众多，主要包括IIFA，ELISA、LIA和Farr法，但各有优缺点。IIFA法以绿蝇短膜虫为基质，虫体内的动基体由纯的环状dsDNA构成，不含有其他抗原，因此具有高度的特异性，该方法被认为是检测抗dsDNA抗体的金标准[3]，本实验中显示该方法发现特异度与阳性预测值最高的是IIFA法(99.3%、97.3%)，但是敏感度最低(38.7%)。灵敏度与阴性预测值最高的是ELISA法(60.2%、77.7%)，与相关报道一致[5，6]。ELISA法将dsDNA包被在聚乙烯板上时，dsDNA容易变性为单链DNA，从而影响抗dsDNA抗体的检测的特异度性，且有报道称某些其他因素如类风湿因子可引起该方法检测抗dsDNA抗体假阳性[7]，但是ELISA能进行定量、半定量测定，该方法在使用过程中应该建立适合本地区的参考区间[8]。LIA法所用膜条上转印着dsDNA抗原的同时也转印着其他多种自身抗原，在检测抗dsDNA抗体的同时只需少量血清即可检测其他多种自身抗体，比如抗线粒体抗体M2型(AMA-M2)[9]。本研究ROC曲线下面积显示3种方法中ELISA诊断价值是最高的，其次是LIA、IIFA。

本文对IIFA与LIA法、IIFA与ELISA法、LIA与ELISA法检出阳性率进行比较，结果显示差异有统计学意义(P<0.05)；一致性分析显示IIFA与LIA法、LIA与ELISA法一致性较好，而IIFA与ELISA法一致性一般。抗dsDNA抗体可分为低亲和力和高亲和力抗体，而不同的检测方法对这两种亲和力抗体检测的敏感度不一样，ELISA和LIA法对低、高亲和力dsDNA抗体都能检测出来，且易受单链DNA的干扰，但是IIFA法对低亲和力抗体敏感度低。有文献报道称dsDNA-IIF和高亲合力抗dsDNA 抗体-ELISA联合诊断SLE敏感率为 90.5%，特异性为 100%[10]。有文献报道LIA与ELISA法一致性较差略有不同[6]。这可能与ELISA法不同厂家的试剂盒有关，而本实验LIA和ELISA法用的是同一厂家的试剂盒，因此一致性较好。因此，建议临床上采用两种方法联合检测dsDNA抗体，这样有助于避免误诊或者漏诊[11]。

综合考虑，ELISA法检测抗dsDNA抗体敏感性高，可进行半定量，但IIFA法特异度最高，因此建议临床上同时应用ELISA法和IIFA法检测抗dsDNA抗体，对SLE诊断和病情活动监测有重要意义。