急性冠脉综合征患者血清LncRNA XIST和miR-330-3p水平表达与心脏自主神经功能的相关性研究

刘英华，王玉霞，卢海英，曾 娟，刘亚宁，高晓丽，王 静

（华北石油管理局总医院a.心内科；b.功能科；c.检验科，河北任丘 062552）

急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是指冠状动脉不稳定斑块破裂并形成血栓，进而导致心肌急性缺血的临床综合征，是造成心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）患者死亡的重要原因[1]。心率变异性（heart rate variability，HRV）是反映调节心脏自主神经功能的重要指标，研究发现，ACS 可导致患者心脏自主神经功能紊乱，心血管事件发生率升高，预后变差[2]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是近些年的研究热点，研究发现其与高血压、冠心病及心脏衰竭有关[3-4]。LncRNA X 染色体失活特异转录物（LncRNA X inactivate-specific transcript，LncRNA XIST）是一种长17 kb 的LncRNA，其通过靶向相应的微小RNA（microRNA，miRNA）来调节各种疾病的病理过程，包括心肌梗死[5]、动脉粥样硬化[6]和癌症[7]。miRNA 是一种高度保守的非编码RNA，包含22 个左右的核苷酸，通过抑制mRNA 的翻译或促进mRNA 的降解而作为基因表达的负调节因子[8]。微小RNA（miR）-330-3p 在非小细胞肺癌[9]、乳腺癌[10]中作为癌基因发挥作用，并与ACS 患者斑块破裂有关[11]。有研究显示，LncRNA XIST 与miR-330-3p 具有靶向关系，LncRNA XIST 通过与miR-330-3p 的相互结合促进星形胶质源性蛋白（S100B）的表达，最终阻止小鼠心肌肥大[12]。因此，本研究通过检测ACS 患者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平，分析其与心脏自主神经功能的关系，以期为临床防治ACS 患者发生心脏自主神经功能障碍提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2020年2月～2021年6月在华北石油管理局总医院诊断为ACS 的患者156例，包括不稳定型心绞痛（unstable angina，UA）80 例（UA 组），其中男性45 例，女性35 例，年龄55 ～86（61.56±11.55）岁，平均收缩压146.72±11.51mmHg，平均舒张压95.43±10.13mmHg，平均体质量指数（BMI）23.35±3.46kg/m2，平均总胆固醇（TC）4.58±0.78mmol/L，平均低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）2.86±0.83mmol/L，平均高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）2.76±0.44mmol/L；吸烟史9 例，饮酒史10 例，高血压9 例，糖尿病10 例。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）76 例（AMI 组），其中男性44 例，女性32 例，年龄52 ～83（60.53±11.39）岁，平均收缩压145.35±11.46mmHg，平均舒张压95.24±10.15mmHg，平均BMI 22.87±3.32kg/m2，平均TC 4.38±0.79 mmol/L，平均LDL-C 2.71±0.86 mmol/L，平均HDL-C 2.86±0.49 mmol/L；吸烟史10 例，饮酒史11 例，高血压12 例，糖尿病13 例。另选取同期体检健康者100 例作为对照组，男性55 例，女性45 例，年龄50 ～82（60.31±10.62）岁，平均收缩压146.48±11.26 mmHg，平均舒张压93.75±9.21 mmHg，平均BMI 23.42±3.15 kg/m2，平均TC 4.62±0.75mmol/L，平均LDL-C 2.68±0.85 mmol/L，平均HDL-C 2.74±0.48 mmol/L；吸烟史10 例，饮酒史12 例，高血压10 例，糖尿病12 例。三组受试者上述资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准通过，受试者均签署知情同意书。

纳入标准：①所有ACS 患者均经冠状动脉造影证实，符合ACS 诊断标准[13]；②纳入对象年龄＞50 岁；③既往无心律失常发病史；④有完整的临床资料。排除标准：①并发肝、肾功能不全或衰竭者；②有系统性免疫缺陷症的患者；③精神病患者；④其他原因引起的心绞痛或心肌病。

1.2 仪器与试剂 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（型号7700 型，美国Applied biosygtems 公司）；动态心电图检测仪（型号TLC4000，秦皇岛康泰医学公司）；Trizol 试剂，反转录试剂盒，荧光定量PCR 试剂盒（批号RP1579-11，RP1105-50T，RL6079-09，上海吉至生化科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：ACS 患者在入院后次日、对照组体检时，清晨空腹经肘静脉抽取外周血5 ml，静置30 min，室温3 000 r/min，离心15 min，离心半径15cm，吸取上清液分别装入EP 管中，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清中LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平：按照Trizol 法提取血清样本中总RNA，分光光度计测总RNA 纯度及浓度，反转录为cDNA。参照荧光定量PCR 试剂盒说明书进行qRT-PCR 反应，LncRNA XIST（内参GAPDH），miR-330-3p（内参U6）引物序列见表1。引物由上海吉至生化科技有限公司合成。反应条件为：95℃10 min；40 个PCR 循环（95 ℃ 10s，60 ℃ 60s，72℃15 s）。采用2-ΔΔCt方法计算血清中LncRNA XIST 和miR-330-3p 相对表达量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 24 h 动态心电图检测：受试者均接受holter检测，并进行HRV 时域分析，检测参数包括24 h内正常R-R 间期标准差（SDNN）、每5 min R-R间期平均值的标准差（SDANN）、每5 min R-R 间期标准差的平均值（SDNN index）、相邻R-R 间期之差的均方根（RMSSD）及相邻R-R 间期相差＞50 ms 心搏数占总心搏数的百分比（PNN50）。1.4 统计学分析 采用统计学软件SPSS 25.0 进行数据分析，计量资料经检验均符合正态分布，以均数±标准差（±s）描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；计数资料以[n（%）]描述，行卡方检验；采用Pearson 法分析ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平与HRV 时域指标的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比较 见表2。与对照组比较，UA 组和AMI 组血清LncRNA XIST 水平升高（t=10.084，21.299，均P＜0.05），miR-330-3p 水平降低（t=12.787，30.011，均P＜0.05）；与UA 组比较，AMI 组血清LncRNA XIST 水平升高（t=10.792，P＜0.05），miR-330-3p 水平降低（t=16.538，P＜0.05），差异均有统计学意义。

表2 受试者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比较（±s）

表2 受试者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比较（±s）

项目对照组（n=100）UA 组（n=80）AMI 组（n=76）FP LncRNA XIST1.09±0.221.37±0.261.69±0.31113.5870.000 miR-330-3p1.03±0.180.82±0.150.53±0.12225.2010.000

2.2 HRV 时域指标水平比较 见表3。与对照组比较，UA 组和AMI 组SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平均降低（t=8.520，16.571；9.525，14.381；11.585，20.497；10.426，17.254；11.261，23.119，均P＜0.05）；与UA 组比 较，AMI 组SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平均降低（t=7.764，4.743，8.625，6.628，11.418，均P＜0.05），差异有统计学意义。2.3 ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平与HRV 时域指标的相关性 见表4。Pearson 相关性分析结果显示，ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平与SDANN，SDNN 无相关性（均P＞0.05）；LncRNA XIST 与SDNN index，RMSSD，PNN50 呈负相关（均P＜0.05）；miR-330-3p 与SDNN index，RMSSD，PNN50 呈正相关（均P＜0.05）。

表3 受试者HRV 时域指标水平比较（±s）

表3 受试者HRV 时域指标水平比较（±s）

项目对照组（n=100）UA 组（n=80）AMI 组（n=76）FP SDANN（ms）133.43±21.01115.96±19.5798.96±16.5769.1380.000 SDNN（ms）136.41±31.53113.84±15.26101.84±11.2254.9230.000 SDNN index（ms）64.68±10.6454.68±6.7246.73±5.14107.1340.000 RMSSD（ms）36.48±8.6227.48±5.6221.37±3.64118.9280.000 PNN50（%）10.72±3.217.58±2.834.18±1.13134.0140.000

表4 ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p水平与HRV 时域指标的相关性

3 讨论

急性冠脉综合征（ACS）属于临床常见严重型慢性静脉功能不全（chronic venous disorder，CVD），也是最危险、最致命的冠心病。根据世界卫生组织的数据，在欧洲，CVD 每年造成超过400 万人死亡，接近所有死亡的45%，其中冠心病占20%[14]。2015年，中国大陆地区冠心病死亡率约为110/10 万，且逐年上升[15]。此外，ACS 还导致心脏自主神经功能紊乱，表现为心脏交感神经兴奋增强，迷走神经活动减少，造成交感神经机制占优势和心电不稳定，此类疾病往往导致心脏交感神经和迷走神经不可逆的损伤。因此，探究ACS 患者心脏自主神经功能及其影响因素，可能有助于防治ACS 患者心脏自主神经功能失调。

长链非编码RNA(LncRNA)在CVD 的病理生理过程中发挥着重要的调控作用。LncRNA 被定义为是超过200 个核苷酸的转录物，功能分析表明，LncRNA 可以在表观遗传、转录和转录后水平调节基因表达，或直接调节蛋白质活性。LncRNA XIST基因位于人染色体Xq13.2，与X染色体失活有关[16]。XIAO 等[17]研究发现，缺氧条件下小鼠心肌细胞中XIST 表达上调；沉默XIST 表达可提高细胞活力，抑制细胞凋亡，并通过降低凋亡相关蛋白水平抑制心肌梗死，提示XIST 参与了心肌梗死的发生，其水平的调节可作为心肌梗死治疗的新策略或潜在靶点。ZHANG 等[18]研究发现，LncRNA XIST 通过调控多种miRNA 参与AMI 的进程中，如在AMI大鼠模型心脏组织中发现，LncRNA XIST 基因敲除可通过下调miR-449 水平抑制AMI 模型大鼠心肌细胞凋亡。缺氧损伤后大鼠心肌细胞中LncRNA XIST 过度表达，XIST 的沉默减轻了细胞损伤；XIST 的上调通过竞争性结合微小RNA（miR）-150-5p 促进B 细胞淋巴瘤2 相关X 蛋白的表达，可能作为AMI 治疗的重要靶点[19]。本研究结果发现，AMI 组血清LncRNA XIST 水平最高，其次为UA 组，对照组血清LncRNA XIST 水平最低，提示LncRNA XIST 升高可能参与ACS 发生。原因可能与LncRNA XIST 参与血管生成、斑块形成及血管平滑肌细胞的凋亡等调节过程有关。

与LncRNAs 不同，miRNAs 是一个进化上保守的内源性家族，可通过不完全互补性与mRNA 的3’非翻译区结合，在血小板聚集、心脏损伤及内皮细胞活化等多种病理过程中发挥重要作用[8]。研究显示，低氧无血清培养的心肌细胞内高表达的miR-330-3p 能抑制心肌细胞凋亡率，是抗心肌细胞凋亡的关键因子[20]。有研究通过高通量测序技术，筛查出miR-330-3p 在缺氧性人AC16 心肌细胞中表达上调，可能为在急性缺氧条件下靶向心肌细胞的新的诊断或治疗策略上提供重要参考[21]。miR-330-3p在动脉粥样硬化病变形成过程中起着关键性作用，LI 等[11]研究报道，血浆miR-330-3p 表达变化与斑块破裂有一定关系，可作为区分ST 段抬高型心肌梗死患者斑块表型的生物标志物。本研究结果发现，对照组、UA 组和AMI 组血清miR-330-3p 水平依次降低，与LI 等[11]研究结果具有相似性，提示miR-330-3p降低可能与ACS发生及病情进展有关。相关研究显示，LncRNA XIST 与miR-330-3p 具有靶向关系[12]，所以二者可能共同参与了ACS 的致病过程，但具体作用机制尚不明确，下一步需补充相关实验继续探讨。

心率变异性(HRV)是公认的评价心脏自主神经功能的非创伤性方法。SCOVELLE 等[22]在ACS 诊断后的12 个月时观察HRV，发现HRV 有性别差异，女性HRV 较低，其心脏自主神经功能也相对较差。高青豹等[23]研究显示，ACS 患者HRV 各项指标均降低，与病情严重程度有关。本研究结果发现，对照组、UA 组、AMI 组SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平依次降低，与高青豹等[23]的研究结果一致。此外，本研究经Pearson分析发现，ACS 患者血清LncRNA XIST 与SDNN index，RMSSD，PNN50 呈负相关；miR-330-3p 与SDNN index，RMSSD，PNN50 呈正相关。提示LncRNA XIST，miR-330-3p 可能与ACS 患者心脏自主神经功能有关，猜测可能是LncRNA XIST 水平升高后，抑制miR-330-3p 的表达，进而促进心肌细胞的凋亡，导致UA 或AMI 的发生。

综上所述，ACS 患者血清LncRNA XIST 水平升高，miR-330-3p 水平降低，与心脏自主神经功能有关，可能作为防治ACS 的重要靶点。本研究未分析ACS 患者炎症因子与LncRNA XIST，miR-330-3p 的关系，可能对于ACS 的心脏自主神经功能障碍的发生揭示不够全面，有待后续深入研究。