难治性肺炎支原体肺炎患儿血清长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子1和烟酰胺核苷酸反义转氢酶RNA1检测的临床意义

冯 华，薛洪刚，徐玉秀

(辽宁省健康产业集团阜新矿总医院a.儿科；b.呼吸内科；c.检验科，辽宁阜新 123000）

肺炎支原体肺炎是小儿常见的呼吸系统感染性疾病，该病具有自限性，大多数患儿病情轻，经大环内脂类抗生素治疗后可痊愈。但是有少部分患儿经足够疗程治疗后临床症状仍未见好转甚至加重，属于难治性肺炎支原体肺炎（refractoryMycoplasma pneumoniaepneumonia，RMPP）[1-2]。RMPP 如若不积极治疗可发展为肺不张、胸腔积液、坏死性肺炎，延长患儿住院时间，增加医疗负担，严重者可导致死亡[3-4]。早期识别RMPP 有助于规范临床治疗，避免不必要的抗生素暴露，减少严重并发症的发生。现有研究显示RMPP 与机体过度炎症反应有关[5]。长链非编码核糖核酸（long non-coding ribonucleic acid，LncRNA）是一类长度超过200nt，自主转录的非编码RNA，主要作用为表观遗传、调控转录及转录后基因表达，现有研究显示LncRNA 肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）可抑制乳腺癌易感基因1（ breastcancer susceptibility gene 1，BRCA1）表达促使中性细胞迁移浸润，诱导炎性因子释放，加重炎症反应[6]。LncRNA 烟酰胺核苷酸反义转氢酶RNA1（nicotinamide nucleotide transhydrogenase -antisense RNA1, NNT AS1）可通过miR-582-5p/ FBXO11 信号通路诱导慢性阻塞性肺疾病炎症反应[7]。然而，LncRNA MALAT1，LncRNA NNT AS1 异常表达是否与RMPP 发病有关尚不清楚，本研究拟探讨LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 在RMPP 患儿中的表达情况，并分析其与RMPP 发病以及治疗疗效的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月1日～2021年1月1日辽宁省健康产业集团阜新矿总医院收治的200 例肺炎支原体肺炎患儿，其中43 例为RMPP（RMPP 组），男性27 例，女性16 例；年龄1 ～12（6.02±2.16）岁。157 例为普通肺炎支原体肺炎（普通肺炎组），男性89 例，女性68 例，年龄2 ～12（6.11±2.45）岁。纳入标准：①病原学检查确认为肺炎支原体感染；②符合第8 版《诸福棠实用儿科学》中肺炎支原体肺炎诊断标准[8]；③CT 提示肺部感染病灶。排除标准：①并发其它病原菌感染；②并发呼吸道感染、哮喘、慢性肺疾病、免疫性疾病；③肺炎支原体肺炎反复住院者，呼吸伪影干扰CT检查者，病历资料缺失者。RMPP 判定标准[9]：规律应用大环内酯类抗生素治疗7天及以上仍有发热、咳嗽等临床症状，C 反应蛋白（CRP）＞40mg/L，肺部影像学加重。另选择同期于辽宁省健康产业集团阜新矿总医院体检健康的100 例儿童为对照组，其中男性55 例，女性45 例，年龄2 ～10(6.33±2.11)岁。三组受试儿童一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），本研究获得辽宁省健康产业集团阜新矿总医院伦理学委员会批准，患儿监护人均知情同意并签署同意书。

1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂(美国Thermo Fisher公司)，M-MLV 逆转录酶(Epicentre 公司)，7500型qRT-PCR 仪(美国ABI 公司)。酶联免疫吸附试验检测试剂盒(美国R&D 公司)，仪器为瑞士Hamilton FAME 全自动酶联免疫分析仪；罗氏Cobas e601 型全自动电化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.3 方法 所有患儿于入院后（对照组体检当日）第2 天抽取空腹静脉血3ml 注入干燥试管，待血液自然凝固后离心10min（3 000r/min，半径10cm）取上清液上机检测。Trizol 法提取RNA，M-MLV逆转录酶将A260nm/A280nm比值位于1.9 ～2.1 的RNA逆转录为cDNA，反应体系20 μl，反应条件:16℃15 min，42℃ 5 min，95℃ 30 s。qRT-PCR 仪检测血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 相对表达量，取2μl cDNA 样品加入qRT-PCR 体系，除cDNA样品外还包括SYBR®Premix Ex Taq™ II（2×）12.5μl，dNTP1.6μl，Taq DNA 聚合酶1μl，上下游引物 10μmol/L 各1μl，反应缓冲液5.9μl。反应条件：95℃预变性10 min, 95℃变性10s, 60℃退火20s, 72 ℃延伸10s，一共做40 个循环。引物合成及序列测定由上海基康生物技术有限公司完成，引物序列：LncRNA MALAT1，上游：5’-CTCCCCACACAAGCAACTTCTC-3’，下游：5’-TTCAACCCACCAAAGACCTC-3’；LncRNA NNTAS1，上游：5’-TGAAGTTTTCAGGGACACAT-3’，下游：5’-TTTAGACCTGTTTCTTTGTT-3’；β-actin，上游：5’-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3’，下游：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGT-3’。以β-actin RNA为内参，2-ΔΔCt法计算LncRNA MALAT1，Lnc RNA NNT-AS1 相对表达量。另取血清样品，采用酶联免疫吸附试验检测血清白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。采用罗氏Cobas e601 型全自动电化学发光免疫分析仪检测血清CRP，降钙素原（procalcitonin，PCT）水平。

收集并整理所有患儿的临床资料，包括性别、年龄、发病季节、热程、体温、病程、血细胞检测指标（白细胞计数、中性粒细胞计数）、影像学特点（受累肺部范围、有无肺大片实变影、有无胸腔积液）、肺外并发症（食欲不振、嗜睡、呕吐、心率加快等）。

临床治疗以及疗效评价：按照《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识(2015年版)》[9]治疗原则给予退热、止咳、平喘等支持治疗，并给予米诺环素口服治疗，首剂顿服4 mg/kg，后2mg/(kg·d)，12 h/次，连续治疗5 天。同时增加甲泼尼龙1 ～2 mg/（kg·d）静脉点滴治疗，疗程3 ～5 天，后改为口服1 mg/（kg·d）治疗5 ～7 天。呼吸道黏液阻塞患儿给予支气管镜治疗。疗效标准[10]：显效：治疗后体温恢复正常，咳嗽症状消失，肺喘鸣音及啰音消失，胸片或CT 示阴影消失；有效：治疗后体温基本恢复正常，咳嗽症状缓解，肺部喘鸣音及啰音明显减少，胸片或CT 显示阴影吸收；无效：治疗后体温、咳嗽症状、肺部喘鸣音及啰音无明显改善或加重，胸片或CT 示阴影无明显变化或明显加重。以显效和有效为有效，43 例RMPP 患儿治疗有效38 例（有效组），无效5 例（无效组）。

1.4 统计学分析 SPSS 25.0 进行数据分析。K-S法检验计量资料拟合优度，以均数±标准差(±s)表示正态分布计量资料，以中位数（P25，P75）[M（Q1，Q3）]表示偏态计量资料，分别采用单因素方差分析（两两对比采用LSD-t检验），Wilcoxon秩和检验。以率(%)表示计数资料，采用χ2检验。Pearson 相关系数描述血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 表达与炎症因子之间的相关性。Logistic 逐步回归分析RMPP 发生的影响因素。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 三组血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNTAS1 及炎症因子水平比较 见表1。RMPP 组血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 及CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平高于普通肺炎组(t=21.087,20.704, 50.002, 15.858, 14.366, 13.653, 均P=0.000)和对照组（t=21.356, 21.235, 180.879, 23.716, 28.244,19.777, 均P=0.000），差异均有统计学意义。普通肺炎组血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1及CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平高于对照组，差异均有统计学意义（t=5.343, 6.905, 47.336, 29.067,20.071, 10.143, 均P=0.000）。

2.2 血 清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1表达与炎症因子的相关性 RMPP 组血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 表达水平与CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平均呈正相关（r=0.922, 0.823,0.786, 0.821；0.873, 0.715, 0.804, 0.812,均P=0.000）。

表1 三组血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 及炎症因子水平比较(±s)

表1 三组血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 及炎症因子水平比较(±s)

项 目RMPP 组（n=43）普通肺炎组（n=157）对照组（n=100）F 值P 值LncRNA MALAT13.26±0.851.32±0.411.05±0.37335.6930.000 LncRNA NNT-AS13.38±0.921.41±0.401.06±0.39335.8280.000 CRP（mg/L）45.24±2.0119.02±3.273.26±0.774 207.1640.000 PCT（μg/L）1.58±0.520.82±0.160.31±0.09457.1870.000 IL-8（μg/L）42.77±8.8426.35±5.9113.02±3.79410.3000.000 TNF-α（μg/L）9.22±2.615.02±1.493.32±0.96214.8750.000

2.3 RMPP 发病的影响因素 RMPP 组热程、体温、病程、白细胞计数、中性粒细胞计数、肺受累范围≥2/3 肺叶人数占比、肺大片实变影人数占比、肺外并发症发生率均大于普通肺炎组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；两组在年龄、性别、发病季节、有无胸腔积液方面比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。以是否患RMPP 为因变量，以LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1，CRP，PCT，IL-8，TNF-α，热程、体温、病程、白细胞计数、中性粒细胞计数、受累肺部范围、肺大片实变影、肺外并发症为自变量纳入Logistic 逐步回归分析，向后逐步法排除无关变量，结果显示肺大片实变影、CRP 高表达、LncRNA MALAT1 高表达、LncRNA NNT-AS1 高表达是RMPP 发病的危险因素（均P＜0.05），见表3。

表2 RMPP 组和普通肺炎组临床资料比较[x±s, n(%), M(Q1,Q)]

表3 RMPP 发病影响因素的Logistic 逐步回归分析

2.4 不同疗效RMPP 血清LncRNA MALAT1，Lnc RNA NNT-AS1表达水平比较 有效组血清LncRNA MALAT1（3.16±0.24），LncRNA NNT-AS1（3.29±0.20）表达水平低于无效组（4.02±0.09，4.06±0.10），差异有统计学意义（t=7.869，8.406，均P＜0.05）。

3 讨论

肺炎支原体肺炎是儿童社区获得性肺炎最常见的形式之一，虽然肺炎支原体感染通常具有自限性，但仍有部分病例在大环内酯类抗生素治疗7 天或更长时间后仍未得到缓解。难治性肺炎支原体肺炎（RMPP）的发病原因复杂，与大环内酯类耐药、并发其它病原体感染和免疫紊乱等有关。RMPP 与普通性肺炎支原体肺炎具有相似临床症状，发病早期难以鉴别，当RMPP 确诊时患儿可能已经出现严重的肺部损伤和肺外并发症，延误治疗时机，加之抗生素滥用、耐药以及糖皮质激素的不规范使用，导致治疗难度大大增加。因此亟需找到可早期诊断RMPP 发生的指标。近年来国内外研究普遍认为细胞免疫介导的炎症反应与RMPP 有关，炎性因子的过度合成和释放被认为是引起RMPP 的主要相关因素[5,11]。

LncRNA 是具有高度组织特异性的RNA，人类和哺乳动物大多数基因组产物以LncRNA 形式存在，LncRNA 可调节绝大多数生理和病理过程，具有调控表观遗传、转录后调节基因表达、调控微小RNA，基因结构重塑、组蛋白修饰等多种生物学功能[12]。现有研究显示多种LncRNA 参与炎性反应调节过程，在急性痛风性关节炎、慢性阻塞性肺疾病、溃疡性结肠炎等炎症性疾病中发挥重要作用[13-15]。

LncRNA MALAT1 是最早被鉴定的与人类疾病相关的LncRNA 之一，已知其参与多种恶性肿瘤的进展和转移过程[16]。近期发现LncRNA MALAT1在炎性疾病中也起着重要的调节作用，LncRNA MALAT1 通过调控miR 146a/核因子 κB（NF κB）促炎信号通路参与脂多糖诱导的急性肾损伤发病过程[17]。LncRNA MALAT1 还可通过miR 149 /髓样分化因子88（MyD88）/NF κB 轴调控炎性因子TNF-α，白细胞介素 1β 和白细胞介素-6 释放，在脂多糖诱导的急性肺损伤中发挥重要作用[18]。LncRNA MALAT1 是否参与RMPP 发病尚不清楚，本研究发现RMPP 组血清LncRNA MALAT1表达水平明显上调，LncRNA MALAT1 表达水平与炎性因子CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平均呈正相关，Logistic 逐步回归分析结果表明LncRNA MALAT1 高表达是RMPP 发病的危险因素，说明LncRNA MALAT1 可能通过调控炎性因子表达参与RMPP 发病。CAO 等[19]人研究结果显示LncRNA MALAT1 过表达可通过miR 181c 5p/高迁移率族1（HMGB1）轴加剧缺血性脑组织炎症反应，敲低LncRNA MALAT1 可下调HMGB1 表达，抑制炎症反应，说明LncRNA MALAT1 在炎性疾病中发挥促炎作用机制，支持本研究结论。推测LncRNA MALAT1 参与RMPP 发病的机制为：NF κB 参与肺炎支原体肺炎的炎症反应过程[20]，LncRNA MALAT1 异常表达依赖NF κB，LncRNA MALAT1通过与NF κB相互作用参与炎症反应调节过程[21]，因此LncRNA MALAT1 可能通过调节NF κB 活化来调节炎症反应，诱导RMPP 发生。

LncRNA NNT- AS1 是一种新发现的细胞质LncRNA，定位于人类5 号染色体，通过与miRNA竞争性影响多种信号通路调控大量下游基因表达参与恶性肿瘤发生和发展[22]。MEI 等[7]人发现LncRNA NNT- AS1 通过调节miR-582-5p / FBXO11信号促使气道炎症反应和重塑，提示LncRNA NNTAS1 具有炎性调节作用。本研究发现LncRNA NNTAS1 在RMPP 组表达水平明显上调，LncRNA NNTAS1 高表达是RMPP 发病的危险因素之一，说明LncRNA NNT- AS1 与RMPP 发病有关。MEI 等[7]人报道显示LncRNA NNT-AS1 在香烟烟雾提取物处理的16HBE 细胞中表达上调，敲低LncRNA NNT-AS1 表达可抑制消除香烟烟雾提取物介导的气道炎症反应，说明LncRNA NNT- AS1 在气道炎症疾病中发挥促炎作用，该作用与LncRNA NNTAS1/miR-582-5p/FBXO11 信号轴调控作用有关。本研究相关性分析结果显示LncRNA NNT -AS1 表达水平与炎性因子CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平呈正相关，推测LncRNA NNT-AS1 过表达可能通过促进炎性反应，诱导和扩大肺部炎症反应，参与RMPP 发病过程。本研究Logistic 逐步回归分析显示CRP 高表达、肺大片实变影与RMPP 发病也密切相关，翟佳羽等[23]人报道也指出肺部影像学表现加重是识别RMPP 的影像学指标，血清CRP 水平升高是RMPP 的独立危险因素，提示血清CRP水平、肺大片实变影也可作为鉴别普通肺炎支原体肺炎和RMPP 的依据，临床可结合患儿肺部CT 及血清CRP，LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1检测进行综合评估。本研究无效组血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 表达高于有效组，提示血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 表达与RMPP 临床治疗疗效也存在密切关系，可作为评估临床疗效的指标。

综上，RMPP 患儿血清LncRNA MALAT1, Lnc RNA NNT-AS1 均呈高表达，且LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 与RMPP 发病、机体炎症反应以及临床治疗效果均有关。