LncRNA NEAT1/miR-23b-3p/KLF3轴调控结直肠癌细胞的生物学功能研究

胡道军，史文杰，孙 敏

（1.上海市新华医院崇明分院检验科，上海 202150；2.桂林市中医医院乳腺外科，广西桂林 541002；3.湖北医药学院附属医院太和医院普外科，湖北十堰 442000）

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种高度恶性的肿瘤，发病率和死亡率都在迅速上升，发现时往往被诊断为临床晚期[1-2]。因此，积极寻求结直肠癌发病的调控基因和治疗靶点，提升病人的生存时间和生活质量迫在眉睫。长链非编码核糖核酸（long non-coding RNAs，LncRNAs）是长度超过200 个核苷酸的转录本，没有或仅有有限的蛋白质编码功能[3-4]，通过与DNA，RNA 或蛋白质的相互作用参与多种致癌过程和疾病发生[5]。LncRNAs 能通过影响癌症的功能特征（比如不受控制的增殖、逃避细胞死亡以及转移形成），或者直接（间接）地通过干扰不同的途径而发挥癌基因或肿瘤抑制因子的作用[6-7]。在结直肠癌中，LncRNAs 还可通过多种调控方式影响结直肠癌细胞的生长，并与结直肠癌的发生、转移和预后密切相关[8]。SALMENA等[9]于2011年提出竞争性内源性核糖核酸（competitive endogenous RNA，ceRNA）假说，认为lncRNA，mRNA 或其他的RNA 分子，可以作为天然mRNA“海绵”，通过共同的miRNA 反应元件(microRNA response elements，MREs)与miRNA 结合从而影响miRNA导致的基因沉默。有研究显示，LncRNA NEAT1 在结直肠癌组织和细胞系中过表达，参与肿瘤增殖、迁移、凋亡等[11]。我们通过生物信息学工具成功预测LncRNA NEAT1/miR23b-3p/KLF3 分子调控轴可能通过ceRNA 参与调控结直肠癌发生。本研究最终以HT29 细胞为实验对象，初步验证该分子轴在结直肠癌的表达情况和调控机制，以期为结直肠癌提供新的策略和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 研究对象 HT29（人结直肠癌细胞株）和HEK293（人胚胎肾293 细胞，用于双荧光基因转染）购自中国科学院上海细胞库。

1.2 仪器与试剂 McCoy’s 5A 完全培养液（凯基生物，货号KGM4892S）；CCK-8 法细胞增殖检测试剂盒（凯基生物，货号KGA317）；Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit Cell Cycle Staining Kit（联科生物）；Trizol 试剂（康为世纪）；qRT-PCR试剂（生命互联）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（ 美国Promega 公司）；KLF3 抗体（Cell Signaling Technology公司），二抗IgG（北京康维公司）。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析：在线工具starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/index.php) 预测miRNA 和lnc RNA 之间的互作关系。利用多个在线工具（PITA,RNA22, miRmap, microT, miRanda, PicTar 和TargetScan）预测miRNA-mRNA 之间的互作关系。最终预测NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 调控轴为研究对象。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库分析NEAT, miR-23b-3p, KLF3 在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达水平及其相关性。

1.3.2 细胞培养与转染：HT29 细胞均置于含10g/dl 胎牛血清的McCoy’s 5A 培养液，37℃和5ml/dl CO2培养箱中培养。实验分为Control 组、NC 组和si-NEAT1 组（取干扰效果最好的一组）。转染前24h，将生长良好的细胞铺于6 孔板上，细胞密度约5×105/孔，待细胞达到70%～90%融合时，按Lipofectamine 2000 转染试剂说明书对HT29 细胞进行转染。

1.3.3 CCK8 检测细胞增殖活性：将转染后的细胞消化、重悬和计数，并向96 孔板加入100μl 细胞悬液（约7 000 个/孔）；培养24h 后使细胞贴壁，再加入10μl CCK8 试剂，置于培养箱中孵育2h，450nm 波长，酶标仪（北京六一生物科技，型号TD4A）检测每孔的吸光值。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡：调整HT29 细胞浓度为1×105个/ml，加1ml PBS 1 500 r/min 离心3 min，洗两遍。取300μl 预冷的1×Binding Buffer 重悬细胞，每管加入3 μl Annexin V-APC 和5μl 7-AAD。轻微混匀后，室温避光孵育 10 min。再向每管中加入200μl 预冷的1×Binding Buffer，混匀后流式仪检测。

1.3.5 流式细胞术检测细胞周期：将细胞悬液1 500 r/min 离心3 min，弃上清。加入1ml PBS,1 500 r/min 离心弃上清，加1 ml DNA Staining solution 和10 μl Permeabilization solution，涡旋振荡5 ～10s 混匀，室温避光孵育30min，流式细胞仪检测（NovoCyte 2060R，杭州艾森生物公司）。

1.3.6 Transwell 检测细胞侵袭能力：转染后的细胞消化收集，1 500 r/min 离心10min，细胞浓度调至1×105/ml。上室加入100μl 无血清的细胞悬液，下室（侵袭小室）加入500μl 10g/dl 胎牛血清培养液。随后放入37 ℃含5ml/dl CO2的培养箱中培养24 h，取出小室，PBS 洗涤3 次。室温下，小室放在95%乙醇中固定5 min；0.5g/dl 结晶紫染色10 min，PBS 漂洗，用棉签轻轻拭去小室滤膜上层细胞，显微镜下观察结果。

1.3.7 划痕实验检测细胞迁移能力：将细胞铺板待密度达到90%以上后进行划线，使用200μl 枪头在每孔进行划痕，弃去培养基，PBS 清洗3 次，换成无血清培养基后给每孔划痕拍照。将细胞放入培养箱中，24h 后再次给每孔划痕拍照。

1.3.8 蛋白质印记法检测KLF3 蛋白的表达：使用细胞裂解液裂解各组细胞样本，4℃ 12 000r/min 离心10min 后（离心半径6.26cm），获得蛋白样品，采用考马斯亮蓝测量蛋白质浓度。取相应体积的蛋白并加入上样缓冲液，混匀后，沸水浴加热3min，使蛋白变性。采用10g/dl SDS-PAGE 凝胶进行蛋白分离，电泳先用80 V，待溴酚蓝进入分离胶后改用120 V，电泳1 ～2 h。在冰浴中进行转膜，转膜电流为300mA，时间为60 min。转膜后把膜放入洗涤液中漂洗1 ～2 min，再将膜放入封闭液中室温封闭60 min。一抗（1:1 000）4℃过夜，二抗室温下孵育2 ～3h，显影检测蛋白表达。

1.3.9 荧光定量PCR 检测各分组基因表达：TRIzol法提取各组总RNA，紫外分光光度法检测RNA 的纯度和浓度。通过逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，以GAPDH 或U6 为内参，每个基因扩增设置3 个复孔。反应条件：95℃预变性10min；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共计40 个循环，伯乐荧光PCR 仪上分析（SYBR Green 荧光染料法）。LncRNA NEAT1 正向引物序列：5’-GTTTGCCTGCCTTCTTGTG-3，反向引物序列：5’-TACCCTCCCAGCGTTTAGC-3’； miR-23b-3p 正向引物序列：5’-CGATCACATTGCCAGGGA T-3’，反向引物序列：5’-AGTGCAGGGTCCGAGG TATT-3’；KLF3 正向引物序列：5’-GAGGCGATCG CCATGCTCATGTTTGACCCAGTTC-3’，反向引物序列：5’-GCGACGCGTTCAGACTAGCATGTGGCG TTTC-3’；GAPDH 正向引物序列：5’-TGACTTC AACAGCGACACCCA-3’，反向引物序列：5’-CAC CCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；U6 正向引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。基因相对表达量以2-△△Ct（△△Ct=△Ct试验-△Ct对照）法计算。

1.3.10 双荧光素酶报告基因检测：将含有预测的miR-23b-3p 靶位点3’-UTR 的野生型（wt）或突变型（mut）NEAT1, KLF3基因克隆到pGL3载体（Promega公司提供，上海）。再使用Lipofectamine 2000 将构建好的载体与mimics miR-23b-3p 共转染HEK293细胞，每组重复3 次；转染48 h 后，双荧光素酶检测试剂盒（Promega）用于分析荧光素酶活性。

1.4 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。如数据呈正态分布，定量结果采用均数±标准差（±s）表示。如数据呈非正态分布，采用中位数（四分位数）[M (P25, P75)]表示。两组之间定量数值比较采用独立样本t检验或Mann-WhitneyU检验。多组之间定量数值比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。生物信息学分析采用R 软件或在线工具完成。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁组织NEAT1, miR-23b-3p,KLF3 的表达及三者相关性比较 见表1。TCGA数据库分析得知，NEAT1 和 KLF3 在结直肠癌组织中表达显著高于癌旁组织，miR-23b-3p 在癌组织中的表达低于癌旁组织，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。其中, NEAT1 与KLF3 表达呈显著正相关（r=0.26,P＜0.01），miR-23b-3p 与NEAT1，KLF3 表达量均呈显著负相关（r=-0.14,P=0.008;r=-0.17,P=0.001）。

表1 结直肠癌组织和癌旁组织NEAT1, miR-23b-3p,KLF3 的表达

2.2 干扰NEAT1 表达（siNEAT1 组）对HT29 细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭的影响 见表2。si-NEAT1 组的凋亡率显著高于Control 组（P＜0.05），见图1A1&A2。siNEAT1 组G0/G1 期细胞比例明显少于对照组（P＜0.001），见图1B1&B2。siNEAT1 组S 期细胞比例显著高于Control组（P＜0.001）。siNEAT1组细胞明显的被阻滞在S 期。siNEAT1 组的侵袭能力明显低于Control 组和NC组（t=8.33, 6.54, 均P＜0.01），siNEAT1 组的增殖能力明显低于Control 组和NC 组（t=5.17, 2.92, 均P＜0.01），siNEAT1 组的迁移能力明显低于Control组(U=0,P＜0.01)。

图1 siNEAT1 对HT29 细胞凋亡和周期的影响

表2 siNEAT1 对HT29 细胞侵袭、增殖和迁移的影响

2.3 miR236-3p 潜在靶点的预测和验证 见图2。在线工具STARBASE 等预测miR-23b-3p 可同时与NEAT1 和KLF3 3’UTR 互补配对（图2A）。双荧光素酶报告基因实验显示，插入wt-NEAT1 或wt-KLF3 序列的载体与mimics miR-23b-3p 共转染HEK293 细胞后，荧光素酶活性显著降低；而插入mut-NEAT1 或mut-KLF3 序列的载体与mimics miR-23b-3p 共转染HEK293T 细胞后，荧光素酶活性没有明显变化，验证了NEAT1 和KLF3 与miR-23b-3p 的靶向结合（图2B～E）。

2.4 NEAT1 通过miR-23b-3p 对KLF3 表达的影响见图3。与NC 组相比，siNEAT1 组的miR-23b-3p表达显著上调（ 2.02±0.33 vs 1.05±0.11），KLF3转录(0.36±0.16 vs 1.00±0.09)和蛋白(0.56±0.08 vs 1.12±0.19 )表达显著下降，差异均有统计学意义（t=4.840 6, 6.038 5, 1.704 9, 均P＜0.05）。与si-NEAT1 组相比，si-NEAT1+miR-23b-3p inhibitor 组miR-23b-3p 表达下调(1.23±0.15 vs 2.02±0.33)，KLF3 转录(1.18±0.16 vs 0.36±0.16)和蛋白(1.14±0.12 vs 0.56±0.08)水平上调，差异均有统计学意义（t=3.774 8，6.276 8，6.965 6，均P＜0.05）。

图2 miR-23b-3p 潜在靶点的预测和验证

图3 NEAT1 通过miR-23b-3p 对KLF3 表达的影响

3 讨论

NEAT1 已被证实在乳腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌、胶质瘤等发挥着重要的致癌作用，且多与肿瘤的预后不良有关[10-14]。乳腺癌的体内动物实验证实，NEAT1 沉默能有效降低肿瘤生长并能显著提升肿瘤对化疗药物顺铂的敏感度[15]。卵巢癌中，敲降NEAT1 基因表达能通过调控miR-770-5p/PARP1 轴显著抑制顺铂的耐药性[16]。NEAT1 还可通过WNT/β-catenin 信号通路促进恶性胶质瘤细胞增殖和肿瘤进展[17]。本研究表明，NEAT1 在结直肠癌中表达上调，并且NEAT1 作为致癌基因促进细胞增殖、迁移、侵袭和抑制细胞凋亡。双荧光素酶实验证实在体外结直肠癌细胞中，miR-23b-3p 分子可特异结合NEAT1 和KLF3 分子。因此，探讨NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 轴在结直肠癌中如何发挥作用具有重要意义。

在结直肠癌组织中，有研究者利用微阵列芯片基因分析法和RT-PCR 检测，不断发现异常表达的miRNA，miRNA 也因此被作为结肠癌的潜在生物标志物[18-19]。miR-23b-3p 可通过下调ZNF281 来提升结直肠癌对5’FU 化疗的敏感度，且其在多种肿瘤中扮演着抗癌角色[20]。又有研究表明miR-23b-3p 在结直肠癌细胞系中显著下调，并能抑制细胞的迁移和侵袭[21-23]，这和本文的研究结果一致，可能进一步证实其在结直肠癌中的肿瘤抑制作用。本研究证实miR-23b-3p 被NEAT1 分子负向调控，这主要是其通过吸附miR-23b-3p 分子而实现的。国内外多项研究证明，miR-23b-3p 被认为是多种肿瘤细胞生理中重要的调控分子。miR-23b-3p 可以通过靶向结合多个下游基因分子（FZD7，PLAU，PTEN 等）调控肿瘤的发生发展[24]。miR-23b-3p 可能参与多种肿瘤发病机制的调控，如通过miR-23b-3p/MRC2轴调控卵巢癌的预后发展[25]，miR-23b-3p 的过表达可能抑制人宫颈癌CasKi 细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化过程[26]。这些结果均有利的证明miR-23b-3p 在结直肠癌和其他肿瘤中发挥着重要的调控作用。

据我们所知，KLF3 在肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等[27-29]多种肿瘤中发挥着致癌基因的作用，但是其在结直肠癌中的表达情况却鲜见报道。生物信息学分析表明，KLF3 在结直肠癌中高表达，且和NEAT1 呈显著正相关。miR-23b-3p 和NEAT1，KLF3 均呈负相关性（P＜0.05），NEAT1 和KLF3呈显著正相关（P＜0.05）。这些结果有利于证明NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 轴在结直肠癌中可能发挥调控作用。体外生物细胞学功能研究进一步在结直肠癌细胞系HT29 中证实miR-23b-3p 能够靶向结合下游基因KLF3，KLF3 转录和蛋白水平表达又受到NEAT1 和miR-23b-3p 分子的精确调控，这可能说明KLF3 在结直肠癌中也是一种致癌基因，NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 轴在结直肠癌中可能发挥关键作用，NEAT1 可通过靶向结合miR-23b-3p 来上调KLF3 表达。但这些仍需要更加详尽的生物学实验去证实。

诚然，本研究也存在一定的不足。首先，仍然需要体内实验进一步证明NEAT1/miR-23b-3p/KLF3的作用。其次，本研究仅选用一种结直肠癌细胞系进行研究，且未对KLF3 分子做深入细致的机制研究等。总之，我们通过体外研究对NEAT1 基因进行一定的功能验证，初步证实了其在结直肠癌中调节细胞增殖、迁移、侵袭和细胞凋亡的功能，鉴定了一种新的 NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 调控轴，可能对结直肠癌发病机制和潜在靶点研究提供新的思路和策略。