子宫内膜异位症患者血清miR-455和FABP4表达水平及临床意义

张 璇，赵爱琴，邹 丹，陆海英，周素芳，王晓庆

（苏州高新区人民医院妇产科，江苏苏州 215000 ）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）是生育年龄妇女常见良性疾病，临床症状主要表现为月经异常、性交痛、不孕不育等，好发于25 ～45 岁育龄女性，发病率为10%～15%，不孕率可达40%，严重影响妇女身心健康[1-2]。EMT 的发病机制尚不清楚，有多种因素参与EMT 的发病和进展过程[3-4]。微小核糖核酸（miRNA）为非编码小分子RNA，与EMT 的发生发展有关，miR-455 为miRNA 的一种，研究表明，miR-455 可靶向抑制基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9 表达，从而降低子宫内膜的血管通透性[5-6]。脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4，FABP4）是一种脂肪细胞因子，研究表明，FABP4 在子宫内膜组织和子宫内膜上皮细胞系中有表达，参与调控子宫内膜上皮细胞系的增殖、迁移和侵袭[7]。目前EMT 患者血清miR-455 与FABP4的水平变化尚缺乏研究，本研究回顾性分析EMT患者血清miR-455，FABP4 的表达情况，探讨miR-455，FABP4 表达水平与EMT 发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2018年6月～2021年3月苏州高新区人民医院妇产科收治的73 例EMT 患者作为观察对象（EMT 组），年龄20 ～45（32.40±4.70）岁。纳入标准：①符合EMT 诊断标准[8]，经腹腔镜手术及病理检测确诊为EMT；②年龄＞18 岁，且月经规律；③近3 个月内未服用对子宫内膜增殖有影响的药物或激素类药物；④患者临床资料完整。排除标准：①卵巢肿瘤、子宫腺肌病、多囊卵巢综合征等疾病患者；②子宫发育异常者；③自身免疫系统疾病患者；④心、肝、肺、肾等重要脏器功能异常者。

根据美国生育协会修订EMT 评分标准分期，其中Ⅰ期患者29 例，Ⅱ期患者16 例，Ⅲ期患者15例，Ⅳ期患者13 例。

另选取同期女性健康体检人员75 例作为对照组，所有体检人员体检无疾病，年龄21 ～47（32.60±5.00）岁。EMT 组与对照组平均年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

研究样本采集均经过本院伦理委员会批准，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 人FABP4 ELISA 试剂盒（美国R&D 公司）；TRIzol 试剂[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）试剂盒（日本TAKARA 公司）；miR-455 及U6 引物由上海生工生物工程公司设计与合成。ABI 7900 型qRTPCR 仪（美国ABI 公司），DU 640 紫外分光光度计（BECKMAN 公司），Multiskan MK3 型全自动酶标仪（芬兰Labsystem 公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品采集及保存：抽取两组观察对象空腹静脉血5ml，室温静置30min，2 000r/min 离心15min，取上层血清，于-80℃冰箱保存。

1.3.2 qRT-PCR 检测两组血清miR-455 的表达：采用qRT-PCR 检测两组观察对象血清miR-455 水平。TRIzol 试剂提取血清总RNA，紫外分光光度计检测RNA 的纯度与浓度，逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板进行qRT-PCR 扩增。总反应体系15μl，其中SYBR Green Mix 6μl，上下游引物各0.5μl，cDNA 2μl，ddH2O 6μl。反应条件：95℃预变性60s；95℃变性15s，65℃退火45s，72℃延伸30s，共35 个循环。每个样品设置3 个复孔。反应结束后，以U6 作为内参，采用2-ΔΔCt分析法计算miR-455表达水平。miR-455上游引物序列：5’ GTGCCTTTGGACTACATC 3’，下游引物序列：5’GAACATGTCTGCGTATCTC 3’；U6 上游引物序列：5’ CTCGCTTCGGCAGCACA 3’，下游引物序列：5’AACGCTTCACGAATTTGCGT 3’。

1.3.3 ELISA 法检测血清FABP4 水平：采用ELISA法检测观察对象血清FABP4，按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学分析 利用SPSS 22.0 进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；Pearson 法分析EMT 患者血清miR-455，FABP4 表达水平相关性，ROC 曲线分析血清miR-455，FABP4 表达对EMT 的诊断价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组观察对象血清miR-455，FABP4 表达水平比较 与对照组比较，EMT 组患者血清FABP4 水平显著升高（17.34±4.25 ng/ml vs 8.56±2.74 ng/ml），miR-455 水平显著降低（0.67±0.08 vs 1.05±0.19），差异均有统计学意义（t=14.977， 15.780，均P＜0.05）。

2.2 不同分期EMT 患者血清miR-455，FABP4 表达水平比较 随着EMT 分期的升高，EMT Ⅰ～Ⅳ期患者血清FABP4 表达水平显著升高（12.65±3.74ng/ml，16.43±4.54ng/ml，20.65± 4.04ng/ml，24.83±4.21ng/ml），血清miR-455 表达水平显著降低（0.87±0.08，0.72±0.06，0.59±0.06，0.41±0.04），差异均有统计学意义（F=31.108，160.947，均P＜0.05）。

2.3 EMT 患者血清miR-455 与FABP4 相关性 见图1。相关性分析显示，EMT 患者血清miR-455 表达水平与FABP4 呈负相关（r=-0.482，P＜0.05）。

2.4 血清miR-455，FABP4 对EMT 的诊断价值 见图2 和表1。血清miR-455 诊断EMT 的曲线下面积为0.879，截断值为0.79，敏感度和特异度分别为83.56%，78.67%。血清FABP4 诊断EMT 的曲线下面积为0.882，截断值为12.51 ng/ml，敏感度和特异度分别为86.42%，79.23%。血清miR-455和FABP4 联合诊断EMT 的曲线下面积为0.922，敏感度和特异度分别为87.67%，81.33%。

图1 EMT 患者血清miR-455 与FABP4 的相关性分析散点图

图2 ROC 曲线分析血清miR-455，FABP4 对EMT 的诊断价值

表1 联合检测Logistic 分析

3 讨论

子宫内膜异位症（EMT）的发病率呈逐年升高趋势，70%～80%的患者有不同程度的盆腔疼痛，严重影响妇女身心健康，目前腹腔镜检查是诊断EMT 的金标准，但其具有有创性，因此寻找有效标志物对EMT 的诊断具有重要意义[9]。

miRNA 在多种疾病的病理生理过程中发挥重要作用，可通过调控靶基因表达，调控细胞增殖侵袭而参与EMT 的发生发展[10]。多项报道显示，miRNA 在EMT 患者血清中异常表达，刘玉瑰等[11]研究表明，EMT 患者血清miR-1304-3p 水平升高，miR-17-5p 水平降低，且与患者病情严重程度和不孕症有关。赵喜艳等[12]研究表明，EMT 患者血清miR-494-5p 与miR-1304-3p 表达水平升高，且随病情进展而逐渐增加，对EMT 的病情进展评估具有一定意义。miR-455 为miRNA 的一种，与慢性乙型肝炎、肺炎、肿瘤等多种疾病有关[13-14]。本研究结果显示，miR-455 在EMT 患者血清中表达水平显著低于健康人群，提示miR-455 可能与EMT 的发生有关；另外III ～IV 期EMT 患者血清miR-455 表达水平显著低于I ～II 期患者，提示miR-455 与EMT 的病情严重程度有关。研究显示[15]，miR-455 可以通过激活Nrf2 信号通路保护成骨细胞免受氧化应激，EMT 的发生机制涉及氧化应激病例过程，本研究推测EMT 患者血清miR-455 水平异常表达，可能与子宫内膜的氧化应激有关。

FABP4 是脂肪因子，调控脂类生成及降解、参与细胞内脂肪酸的转运和代谢，FABP4 还可调控肿瘤细胞脂肪酸代谢，参与调控肿瘤细胞的增殖与迁移[16]。研究表明[17]，FABP4 与胚胎植入有关，抑制子宫内膜上皮细胞中FABP4 可消除雌激素和孕激素联合诱导的子宫受体的表达，并减少黏附在子宫内膜细胞上的滋养细胞球体的数量。miR-455 可通过调节FABP4 来保护人类子宫内膜基质细胞免受氧化应激损伤[18]。本研究结果显示，与对照组比较，FABP4 在EMT 组患者血清中水平升高，提示FABP4 可能促进细胞增殖，与EMT 发生发展过程有关。

目前EMT 的病因及发病机制尚不完全清楚，多项报道显示，异位内膜细胞的黏附、侵袭、氧化应激、血管生成是主要病理生理过程[19]。虽然EMT 为良性疾病，但也具有侵袭性、易转移和复发等与肿瘤类似的生物学特性，EMT 还与卵巢癌发生、发展具有密切的关系[20]。本研究推测miR-455，FABP4 参与EMT 的发展可能与miR-455，FABP4 参与血管生成、细胞增殖与侵袭有关。本研究还发现，EMT 患者血清miR-455 表达水平与FABP4 呈负相关，表明二者可能存在负向调控关系。唐文波等[21]研究表明，miR-455 可通过靶向调控FABP4 而保护过氧化氢诱导的人子宫内膜间质细胞氧化应激损伤。本研究推测miR-455 可能通过靶向调控FABP4 的表达参与EMT 的发生与发展。进一步分析发现，血清miR-455，FABP4 联合诊断EMT 的曲线下面积为0.922，敏感度和特异度分别为87.67%，81.33%，提示miR-455 和FABP4 联合检测对于早期诊断EMT 具有一定价值，有一定临床应用意义[22]。

综上所述，血清miR-455，FABP4 在EMT 患者中分别呈低、高表达，均与患者病情相关，可能作为EMT 早期诊断的分子标志物。但由于本研究临床样本数据少，结果可能存在一定偏倚，后续仍需扩大样本量做进一步研究。