LncRNA NEAT1在心力衰竭中的临床意义及其对心肌细胞损伤的影响

彭思思，陈 乔，王鹏云

心力衰竭是心脏疾病发展的终末阶段，常见于中老年人，但近年来在年轻群体中越来越常见[1-2]。研究显示，全球心力衰竭的发病率高达1%～3%，近年来呈现不断上升的趋势[3-4]。心力衰竭可引起不同程度的呼吸衰竭、咳血、失眠无力及神经系统疾病等，更有严重者存在一定的猝死风险[5]。目前，临床发现心力衰竭主要由高血压、糖尿病或者基础心脏病等引起，且通常存在反复发作的情况[6]。对于心力衰竭的诊断，需要依靠X线检查、超声心动图等影像技术[7]。虽然其诊断准确性较好，但并不利于早期心力衰竭大范围的临床筛查。而对于心力衰竭的治疗，目前尚无有效的完全根治方案，临床主要通过长时间的保守控制治疗降低心力衰竭的潜在威胁[8]。因此，充分了解心力衰竭的发病机制，寻找到新的诊治方案将是降低其潜在威胁的关键。

近年来，研究学者将目光聚焦在长链非编码RNA(LncRNA)[9]。LncRNA作为一种已被证实参与了多项慢性疾病、心脏疾病的重要因素，具有成为疾病诊断标志物、分子治疗靶点的重要意义[10-12]。其中，LncRNA NEAT1是近年来被发现的家族成员之一，最早被证实参与了冠心病的发生[13]。随后，陆续有研究指出NEAT1还与心肌梗死、心肌细胞缺氧也密切相关[14-15]，但与心力衰竭的关系尚不清楚。推测NEAT1可能同样参与了心力衰竭的发生，且有望成为未来心力衰竭的诊治突破口。本研究将通过探究NEAT1在心力衰竭中的价值，为未来临床诊治心力衰竭提供新的参考依据。

1 资料与方法

1.1 病人信息与纳入、排除标准 选取2019年8月—2020年10月江汉大学附属医院武汉市第六医院收治的高血压合并心力衰竭病人87例(观察组)及同时期高血压病人95例(对照组)为研究对象。心力衰竭病人中左心衰竭54例，右心衰竭28例，全心衰竭5例。两组临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组入选标准：高血压病人；确诊为慢性心力衰竭；年龄20～70岁；病例资料完整。观察组排除标准：合并多项心脑血管疾病、免疫性缺陷疾病、感染性疾病、精神障碍疾病、肿瘤疾病病人；肝肾功能不全病人；药物过敏病人；入院前半年内接受了手术、放疗、化疗、抗生素类药物治疗病人；转院病人。对照组入选标准：高血压病人；病例资料完整；无重大既往病史；年龄20～70岁。对照组排除标准：合并其他心脑血管疾病病人。本研究已获得医院伦理委员会批准，病人均签署知情同意书。

1.2 细胞信息 人心肌细胞AC16，购自American type culture collection(ATCC)。培养于90% DMEM高糖培养液中，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中。

1.3 治疗方法 两组病人入院后均进行常规降血压、降血脂治疗，观察组给予常规强心-、利尿及扩张血管治疗，连续2周。此外，口服卡维地洛(齐鲁制药有限公司生产，国药准字H20000100)，初始剂量为每次3.125 mg，每日2次；耐受性良好则在服用7 d后增加至每次6.250 mg，每日2次；每2周增加1倍剂量，目标剂量25 mg/d，持续治疗3个月。并对病人进行为期1年的随访，记录病人治疗后疾病复发情况。

1.4 样本采集 抽取观察组治疗前(入院时)、治疗后(治疗3个月时)以及对照组治疗前空腹静脉血4 mL于促凝管中，室温下静置30 min后离心(1 505×g，10 min)，取得上层血清放入-80 ℃冰箱中待测。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测 TRIzol提取待测物总RNA，按照说明书逆转录为cDNA进行扩增，以β-actin与U6为内参(美国Invitrogen设计)，2-△△ct法计算基因表达。引物序列详见表1。

表1 引物序列

1.6 细胞转染 取对数生长期AC16接种于12孔板，Lipofectamine®2000将靶向升高NEAT1表达载体(NEAT1-sh)及对照空载体(NEAT1-sh-NC)、靶向沉默NEAT1表达载体(NEAT1-si)及对照空载体(NEAT1-si-NC)；miR-342-3p模拟物序列(miR-342-3p-mi)及阴性对照(miR-342-3p-mi-NC)、miR-342-3p抑制物序列(miR-342-3p-in)及阴性对照(miR-342-3p-in-NC)分别转染至AC16中。

1.7 CCK-8实验 取转染后AC16接种于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。分别于培养24 h、48 h、72 h、96 h时取一孔加入10 μL CCK-8，用酶标仪检测吸光度值(450 nm)。

1.8 流式细胞计数 取转染后AC16胰酶消化，加入Binding Buffer重悬，随后依次加入5 μL的Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)与碘化丙啶(PI)，流式细胞仪检测凋亡率。

1.9 双荧光素酶报告实验 在线靶基因预测网站ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析NEAT1与miR-342-3p的关系；构建NEAT1双荧光素酶报告质粒(WT与MUT)，将miR-342-3p-mi与miR-342-3p-mi-NC与之共转染到AC16中。温育48 h后，测定荧光活性。

2 结 果

2.1 NEAT1、miR-342-3p的临床意义 观察组NEAT1表达高于对照组，而miR-342-3p表达则低于对照组(P<0.05)。ROC曲线分析显示，当NEAT1取截断值为1.785时，预测高血压病人发生心力衰竭的灵敏度为67.82%，特异度为78.95%，曲线下面积(AUC)为0.800，95%CI(0.737，0.864)；而当miR-342-3p取截断值为4.315时，预测高血压病人发生心力衰竭的灵敏度为72.41%，特异度为70.53%，AUC为0.751，95%CI (0.681，0.822)。详见图1。

图1 NEAT1、miR-342-3p的临床意义

2.2 NEAT1、miR-342-3p的预后意义 观察组治疗后 NEAT1降低(P<0.05)，miR-342-3p升高(P<0.05)。预后随访中成功随访到所有病人，22例出现心力衰竭复发，总复发率为25.29%。预后复发病人治疗后 NEAT1明显高于未复发病人(P<0.05)，而miR-342-3p低于未复发病人(P<0.05)。ROC曲线分析显示，当治疗后NEAT1取截断值为1.670时，预测心力衰竭复发的灵敏度为90.91%，特异度为84.62%，AUC为0.917，95%CI(0.860，0.974)；而当治疗后miR-342-3P取截断值为4.560时，预测病人心力衰竭复发的灵敏度为95.45%，特异度为83.08%，AUC为0.896，95%CI(0.823，0.969)。详见图2。

图2 NEAT1、miR-342-3p的预后意义

2.3 NEAT1对AC16的影响 NEAT1-sh组NEAT1水平较NEAT1-sh-NC组升高(P<0.05)，而NEAT1-si组则较NEAT1-si-NC组降低(P<0.05)，证实转染成功。生物学行为检测结果显示，NEAT1-sh组增殖能力低于NEAT1-sh-NC组(P<0.05)，凋亡率高于NEAT1-sh-NC组(P<0.05)；而NEAT1-si组则增殖能力高于NEAT1-si-NC组(P<0.05)，凋亡率低于NEAT1-si-NC组(P<0.05)。详见图3。

图3 NEAT1对AC16的影响

2.4 miR-342-3p对AC16的影响 miR-342-3p-mi组miR-342-3p水平较miR-342-3p-mi-NC组升高，miR-342-3p-in组则较miR-342-3p-in-NC组降低(P<0.05)，证实转染成功。miR-342-3p-mi组增殖能力高于miR-342-3p-mi-NC组(P<0.05)，且凋亡率低于miR-342-3p-mi-NC组(P<0.05)；miR-342-3p-in组增殖能力低于miR-342-3p-mi-NC组(P<0.05)，且凋亡率高于miR-342-3p-mi-NC组(P<0.05)。详见图4。

图4 miR-342-3p对AC16的影响

2.5 NEAT1与miR-342-3p的关系 ENCORI显示，NEAT1与miR-342-3p存在可结合的互补位点，NEAT1-WT的荧光活性在转染了miR-342-3p-mi后可见明显降低(P<0.05)。而PCR检测显示NEAT1-sh组miR-342-3p表达水平低于NEAT1-sh-NC组(P<0.05)，而NEAT1-si组则高于NEAT1-si-NC组(P<0.05)。详见图5。

图5 NEAT1与miR-342-3p的关系

3 讨 论

心力衰竭作为临床中的高发、高危疾病，深入了解其发病机制是未来诊治心力衰竭的关键[16]。LncRNA作为目前临床研究的热点，其优势在于不仅可以成为疾病的特异性标志物，还可能通过基因靶向治疗取得优于目前临床治疗现状的效果[17]。目前，NEAT1与心力衰竭的关系还有待证实，且本研究在收集实验资料时发现miR-342-3p在心力衰竭小鼠中存在异常表达[18]，且Wang等[19]研究认为miR-342-3p与NEAT1可能存在一定关系。一方面可以从侧面验证NEAT1对于心力衰竭有着重要意义；另一方面也提示NEAT1在心力衰竭中的作用机制可能与miR-342-3p存在关系。

本研究首先对NEAT1与miR-342-3p在心力衰竭中的表达进行了初步检测，结果显示，NEAT1在心力衰竭中呈高表达，而miR-342-3p呈低表达，提示两者可能参与了心力衰竭的发生、发展。而在既往研究中发现糖尿病病人NEAT1也升高[20]，miR-342-3p在阿尔茨海默病病人中降低[21]，可初步佐证本实验结果。随后，ROC曲线分析显示NEAT1与miR-342-3p对于预测心力衰竭的发生有着较好的效果，其中NEAT1的诊断特异度更是达到了78.95%。相较现临床中对于心力衰竭的诊断方案(以影像结果为主)，不仅检查过程较为复杂，且对于结果的判定主要是依据阅片医师的主观意识判断，对于不典型的心力衰竭可能存在误诊、漏诊风险[22]。而NEAT1与miR-342-3p作为在血液、体液、组织、细胞中均可以被检测到的分子标志物[23]，不仅检测样本获取、保存简单，且可以实施大范围、大数据的临床筛查，提高心力衰竭的早期诊断率。本研究还发现观察组病人治疗后NEAT1明显降低，miR-342-3p升高，更进一步证实了两者参与了心力衰竭的病情发展。且预后随访显示，NEAT1与miR-342-3p对于预测病人的疾病复发同样具有较好的效果，为未来两者作为心力衰竭标志物奠定了良好的基础。

心力衰竭的发生与心肌细胞的活性降低，加速凋亡密切相关[24-25]，而目前NEAT1与miR-342-3p参与心力衰竭的机制仍不清楚，本研究通过心肌细胞AC16进行了体外实验进行探究，结果显示，在AC16中沉默NEAT1与过表达miR-342-3p均可以造成细胞活性的增强，凋亡降低，而升高NEAT1与抑制miR-342-3p则反之，初步证实了NEAT1与miR-342-3p在心力衰竭中的作用机制。且高表达的NEAT1与低表达的miR-342-3p可以促进心力衰竭发展的情况也与上述检测结果符合。最后，通过双荧光素酶报告实验可知NEAT1-WT的荧光活性明显受到miR-342-3p-mi的抑制，证实了两者间存在靶向调控的关系。在升高NEAT1后，可以发现AC16中miR-342-3p明显降低，而沉默NEAT1则可使miR-342-3p升高，可知在心力衰竭病人中NEAT1靶向抑制miR-342-3p。

本研究对NEAT1与miR-342-3p在心力衰竭中的作用进行了初步分析，仍存在诸多不足之处有待改进。首先，本研究纳入的研究对象均为慢性心力衰竭病人，尚不清楚NEAT1与miR-342-3p在急性心力衰竭中的情况是否与本研究结果一致。而对于NEAT1靶向调控miR-342-3p影响AC16的相关信号通路目前还不清楚，有待更完善的实验确认。且由于实验周期较短，无法评估病人的远期预后情况。

NEAT1在心力衰竭中呈高表达，通过靶向抑制miR-342-3p促进心肌细胞的凋亡，从而参与心力衰竭的发生、发展，两者对于未来临床诊治心力衰竭有着重要的意义。