基于TLR/NF-κB通路探究蓬子菜总黄酮对动脉粥样硬化模型家兔的干预效果

徐 丹 ，陶永梅，宋 丹，周振兴，周 悦，王瑞珩，刘树民

动脉粥样硬化属于循环系统疾病，是心血管内科常见疾病，也是动脉硬化最重要也最常见的一种类型，发病位置为血管处，按照动脉粥样硬化受累动脉部位可以分为肠系膜动脉、冠状动脉、脑动脉、四肢动脉硬化等，动脉粥样硬化临床表现多为体力衰退、脑力衰退，并会随着血管斑块的形成，不同的病变部位也会出现不同程度的缺血症状，其中脑缺血会引起头晕、眩晕以及晕厥等症状[1-3]。有研究证明，服用蓬子菜总黄酮可以减轻动脉粥样硬化临床症状，蓬子菜总黄酮可通过抑制Toll样受体(TLR)/核转录因子-κB(NF-κB)的表达，进而改善血管病变[4]。现有的药物及手术治疗方法只能短时间控制病情，见效快，但西药副作用较大，且不能根治此病，但目前缺乏关于蓬子菜总黄酮用于动脉粥样硬化模型家兔的相关资料。故本研究基于TLR/NF-κB通路研究蓬子菜总黄酮对动脉粥样硬化模型家兔的干预效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取75只家兔，由广东金石医疗科技服务有限公司提供[动物许可证号：SYXK(粤)2020-0232]，兔龄3～5(3.80±0.95)个月，体质量225～263(231.80±18.05)g，将家兔放置在室温23～25 ℃、湿度40%～70%、自然光照、通风的无病原菌的干净笼子中饲养，饮用水和食物均经消毒。本实验经我院伦理委员会批准。主要试剂及药物来源：酶联免疫试剂盒购自南京赛泓瑞生物科技有限公司；TLR3抗体购于上海群己生物科技有限公司；NF-κB p62抗体购于上海梵态生物科技有限公司；蓬子菜全草的药物均购自同仁堂。

1.2 实验方法

1.2.1 建模 在75只家兔中随机选取15只作为正常组，不做任何处理，其余家兔随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组15只，参照李枚娟等[5]研究建立动脉粥样硬化家兔模型，除正常组外，其余各组家兔均在早晨将尼古丁25 mg/kg溶于花生油对家兔进行灌胃，18：00时使用与早晨相同剂量的尼古丁重复灌胃，同时给予高脂饲料诱发家兔动脉粥样硬化，每周2次，持续2周，正常组灌胃等体积生理盐水。建模成功标准：家兔出现动脉粥样硬化症状。

1.2.2 给药 将蓬子菜全草粉碎，采用75%乙醇进行提取，醇提液浓缩至一定密度，乙醇洗脱液浓缩后干燥，得总黄酮，检测纯度是否达到59%，保存备用。低剂量组、中剂量组、高剂量组家兔分别给予蓬子菜总黄酮灌胃6周，剂量分别为0.05 mg/kg、1.00 mg/kg、1.50 mg/kg，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。

1.2.3 病理组织学观察 家兔灌胃6周后，禁食不禁水12 h，麻醉处死，迅速摘取主动脉后立即固定在染色液中，将所制备的家兔主动脉组织样本在甲醛溶液中固定24 h后，行常规脱水、透明、石蜡包埋，制备厚度为4 μm的组织切片，取主动脉组织石蜡包埋切片，经苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片后，显微镜下观察并拍照分析。

1.2.4 检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平 抽取各组家兔的空腹静脉血2 mL，离心半径5 cm，32 s平均转速3 000 r进行离心处理3 min，分离上层血清，在-42 ℃的环境下保存备用，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-6、IL-1α、TNF-α、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平，实验步骤：设置10个标准孔并准备相应水平标准品，设置1个空白孔及若干待测样品在10 μL待测样品中加入40 μL样本稀释液，封板膜封板，置于37 ℃水浴箱温育30 min，清洗反应板5次，每次间隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶标液50 μL，封膜温育30 min，清洗反应板5次，每次间隔30 s，拍干，在各孔中加入显色A液、B液各50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光环境下显色15 min，在反应孔内加入终止液每孔50 μL以终止反应，450 nm波长测量每孔吸光度，检测IL-6、IL-1α、TNF-α、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。

1.2.5 检测6-酮-前列腺素(6-keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)水平 用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基制备1×105/mL细胞悬液，均匀接种于2个24孔板，每组设6个复孔，每孔细胞悬液1 mL。在细胞完全贴壁并将细胞放置培养箱直到细胞近50%汇聚时，换用不同含血清的DMEM同步化处理24 h，弃上清，加入干预培养基进行实验：正常组加入正常组培养基1 mL 24 h，吸去上清液；模型组加入模型组培养基1 mL 24 h，吸去上清液；低剂量组、中剂量组、高剂量组加入低剂量组、中剂量组、高剂量组培养基1 mL 24 h，吸去上清液。在37 ℃细胞培养箱中培养24 h，取上清液用放射免疫法检测6-keto-PGF1α、TXB2含量。

1.2.6 测定TLR/NF-κB信号通路蛋白表达量 采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测蛋白表达量，实验步骤：将主动脉组织接种于6孔板中，24 h贴壁后各组进行处理，并使用二喹啉甲酸(BCA)法测定浓度，制备电泳样品，上样量50 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入脱脂奶粉封闭1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，洗膜，每次5 min，共3次，二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，洗膜，每次5 min，共3次，取重叠值。采用软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白为GAPDH。

2 结 果

2.1 各组家兔病理组织学观察 正常组家兔血管平滑肌细胞排列整齐，不存在脂质沉积，色泽较鲜艳，未见粥样硬化斑块；模型组家兔主动脉壁增厚，内膜下存在脂质沉积，存在大量泡沫细胞以及明显的动脉粥样硬化斑块；药物干预后，低剂量组、中剂量组家兔血管平滑肌细胞排列相对规整；高剂量组家兔视血管平滑肌细胞结构基本完整，未见明显脂质沉积。详见图1。

图1 各组家兔病理组织学观察(HE，×400)

2.2 各组家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平比较 高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组IL-6、IL-1α、TNF-α水平均高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组、中剂量组、低剂量组IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组、中剂量组IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平比较(±s) 单位：ng/L

2.3 各组家兔6-keto-PGF1α、TXB2水平比较 中剂量组、低剂量组、模型组6-keto-PGF1α水平均低于正常组，TXB2水平均高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组、中剂量组、低剂量组6-keto-PGF1α水平高于模型组，TXB2水平低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组、中剂量组6-keto-PGF1α水平高于低剂量组，TXB2水平低于低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组6-keto-PGF1α水平高于中剂量组，TXB2水平低于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组家兔6-keto-PGF1α、TXB2水平比较(±s) 单位：mg/L

2.4 各组家兔TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较 中剂量组、低剂量组、模型组TG、TC、LDL-C水平均高于正常组，HDL-C水平均低于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组、中剂量组、低剂量组TG、TC、LDL-C水平低于模型组，HDL-C水平高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组、中剂量组TG、TC、LDL-C水平低于低剂量组，HDL-C水平高于低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组TG、TC、LDL-C水平低于中剂量组，HDL-C水平高于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组家兔TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较(±s) 单位：mmol/L

2.5 各组家兔TLR/NF-κB通路蛋白表达水平比较 中剂量组、低剂量组、模型组TLR3、NF-κB p62水平高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组、中剂量组、低剂量组TLR3、NF-κB p62水平低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组、中剂量组TLR3、NF-κB p62水平低于低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图2。

表4 各组家兔TLR/NF-κB通路蛋白表达水平比较(±s)

图2 各组家兔TLR/NF-κB通路蛋白表达条带图

3 讨 论

动脉粥样硬化属于心血管疾病，已逐渐成为我国居民最主要的死亡原因。心血管系统是人体重要的血管系统之一，该处的血管容易堵塞，动脉粥样硬化是血管病中最常见的一种，当血管发生老化以及衰退时，血管内脂肪以及类脂等物质聚集成斑块，呈黄色粥样，斑块数量达到一定限度时会造成血管壁增厚、变硬，从而失去弹性，形成动脉粥样硬化[6-7]。动脉粥样硬化会引起心律失常以及心绞痛，甚至会造成严重的器官损伤，目前主要的治疗方法只能短时间控制病情，且治疗效果与病变的程度、部位以及血管狭窄程度、受累器官受损等因素有关[8]。如心血管系统受损则会严重地影响病人的日常生活，甚至危及生命。且目前有效治疗动脉粥样硬化的方法较少，常采用西药进行病情控制，但西药不能根治此病，且副作用较大，为更好地研究出有效的治疗方案，本研究基于TLR/NF-κB通路探讨蓬子菜总黄酮对动脉粥样硬化模型家兔的干预效果，为动脉粥样硬化的治疗提供参考。

动脉粥样硬化会增加毛细血管的阻力，造成严重的器官损伤，蓬子菜具有行血、清热解毒、利胆的功效，主要含有黄酮、环烯醚萜、蒽醌、有机酸等化学成分，是从中药和天然植物中提取的黄酮类化合物，具有明显的抗氧化以及清除自由基的作用[9]。董均明等[10]研究发现，蓬子菜总黄酮可以降低毛细血管的血管阻力以及血管渗透性，对血管内皮细胞的损伤有着较强的保护作用。朱玉良等[11]研究发现，蓬子菜总黄酮有诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株细胞凋亡的作用。目前，关于蓬子菜总黄酮在动脉粥样硬化中应用效果的研究较少，本研究发现，蓬子菜总黄酮可明显减轻动脉粥样硬化家兔毛细血管阻力，其原因可能与蓬子菜黄酮类成分具有明显的抗氧化以及清除自由基的作用，且生物利用度高，最终发挥改善动脉粥样硬化毛细血管阻力的作用有关。

IL-6、IL-1α、TNF-α属于炎性细胞因子，IL-6具有较强的抗感染以及免疫防御功能，对血管内皮细胞具有一定的保护作用[12]。而TNF-α是一种多功能的细胞因子，高水平的TNF-α会诱发细胞产生凋亡刺激因子以及中性粒细胞黏附，同时还会活化中性粒细胞，从而导致血管内皮细胞产生氧自由基或者蛋白酶[13]。易琼等[14]研究发现，IL-6可作用于多种靶向细胞，对细胞的生长以及分化具有调节及诱导作用，可参与内皮细胞损伤、单核细胞内膜下迁移以及促凝性质的改变，并可与其他炎性细胞因子起到协调的作用。有研究发现，TNF-α具有多重生物学效应，可导致炎症，促进内皮素的产生，促进动脉粥样硬化的形成[15]。本研究发现，蓬子菜总黄酮治疗后，家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平明显降低，此类药物还具有消肿、抗炎的作用，说明IL-6、IL-1α、TNF-α可反映机体炎症反应。

动脉粥样硬化家兔在发病期会出现血小板过度激活的现象，从而导致TXB2释放增加。杨雪等[16]研究发现，TXB2具有强烈的血小板聚集以及收缩血管功能，会导致血管以及血管内形成微血栓。本研究结果显示，蓬子菜总黄酮治疗可降低TXB2水平，升高6-keto-PGF1α含量，说明蓬子菜总黄酮有抑制血小板TXB2合成及促进6-keto-PGF1α生成的作用，可发挥抗动脉粥样硬化的作用。动脉粥样硬化等心脑血管疾病的发生与机体脂质过氧化作用密切相关[17]。郑曲等[18]研究发现，调节机体脂质代谢水平可提高家兔的抗脂质过氧化能力，预防心脑血管疾病，提高HDL-C水平，影响血清TC、TG、LDL-C水平，从而调节机体的脂质代谢。本研究发现，蓬子菜总黄酮治疗后家兔TG、TC、LDL-C水平明显降低，HDL-C水平明显升高，说明蓬子菜总黄酮可很好地治疗动脉粥样硬化，调节机体脂质代谢水平。

TLR/NF-κB通路是较为常见的信号通路之一，此信号通路被证实在多种疾病中存在表达失调现象，是一条重要的调节通路，其中TLR3、NF-κB p62是TLR/NF-κB通路中的蛋白因子[19-20]。此通路可促进动脉粥样硬化性疾病的发展，研究发现，通过调控TLR3、NF-κB p62表达，可阻止动脉粥样硬化的病变进程，减轻炎症反应以及免疫紊乱[21]。TLR3可以在内皮细胞中广泛表达，耿瑞丽等[22]研究表明，激活TLR3不仅可以损伤内皮细胞功能，还会促进疾病的进展，TLR3的激活还可以诱导具有抗炎效应的炎性基因，此外，TLR3的激活还可以抑制动脉损伤后新生内膜的形成及内膜弹性薄层的断裂。NF-κB信号机制可促进动脉粥样硬化的疾病进展，引起抗微生物感染的免疫应答，介导固有免疫向获得性免疫转换。有研究发现，NF-κB可促进炎症的发生发展，加重动脉粥样硬化[23]。故本研究中高剂量蓬子菜总黄酮可能通过抑制TLR/NF-κB信号通路，下调TLR3、NF-κB p62表达，缓解动脉粥样硬化的发展。

综上所述，蓬子菜总黄酮可能通过调控TLR/NF-κB信号通路中相关重要信号传导分子的蛋白表达，降低动脉粥样硬化模型家兔毛细血管的血管阻力以及血管的渗透性。