血清外泌体LncRNA-CCAT1表达对乙型肝炎病毒相关原发性肝细胞癌诊断价值分析

李兰花

我国是乙型肝炎(乙肝)患者和肝炎病毒携带人数最高的国家，且临床调查显示乙肝病毒(HBV)携带者占我国总人口10%左右[1-2]。原发性肝细胞癌是常见的一种恶性肿瘤，其发生与HBV慢性感染间存在明显的流行病学关系，严重威胁患者生命安全[3-4]。因此，采取及时有效的诊断和治疗HBV相关原发性肝细胞癌方法尤为重要。近年来，外泌体的临床和机制研究受到重视。外泌体主要是由多种类型细胞分泌的一种小囊泡，外泌体中含丰富的mRNA和蛋白质。长链非编码RNA(LncRNA)是长度超过200nt的一类非编码RNA，主要参与基因转录、转录后调控以及表现遗传调控等过程。研究报道显示，LncRNA-结肠癌相关转录因子1(CCAT1)在多种肿瘤中异常高表达，并且与肿瘤分期及患者预后相关[5-6]。但目前，临床上尚无有关LncRNA-CCAT1与原发性肝细胞的相关报道。本研究探讨血清外泌体LncRNA-CCAT1表达对HBV相关原发性肝细胞癌诊断价值，旨在为临床诊断、治疗及预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院于2017年1月至2019年1月收治的HBV相关原发性肝细胞癌患者79例作为观察组。纳入标准：①依据《慢性乙型肝炎防治指南》[7]中关于HBV诊断标准，且临床表现、影像学及经病理学证实为原发性肝细胞癌；②预计患者生存期超过3个月者；③患者临床资料完整，且患者随访资料完整；④获得患者知情同意。排除标准：①甲、丙、丁和戊型肝炎；②其他非乙肝原因引起的肝脏损伤；③合并其他恶性肿瘤者；④严重精神疾病者；⑤心、肺、肾功能严重异常者。纳入的79例患者中，其中，男49例，女30例；年龄43～78岁，平均年龄(62.13±7.68)岁；病程3～21年，平均病程(11.36±3.25)年；平均体质量指数(BMI)(23.12±1.26)kg/m2。选择我院于2017年1月至2019年1月收治的单纯HBV患者83例作为对照组，其中，男54例，女29例；年龄45～79岁，平均年龄(62.64±6.54)岁；病程3～20年，平均病程(10.92±3.46)年；平均BMI(22.89±1.30)kg/m2。另选择我院于2017年1月至2019年1月健康体检者80例作为正常组，其中，男47例，女33例；年龄41～79岁，平均年龄(62.48±3.65)岁；平均BMI(22.71±1.23)kg/m2。三组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者均经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 肝功能检测 受试者均于清晨空腹采集外周静脉血3 mL，以2 500 r/min离心半径10 cm，离心12 min，取上清液(血清标本)，置于-70 ℃保存待测，采用放射免疫法测定谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平，应用Dxc 800TB全自动生化仪及配套试剂盒，严格按照试剂盒标准测定。

1.2.2 血清外泌体LncRNA-CCAT1表达 受试者均于清晨空腹采集外周静脉血3 mL，以2 500 r/min离心半径10 cm，离心12 min，取上清液(血清标本)，置于-70 ℃保存待测。①总RNA提取：取出样品解冻后加入Trizol试剂(北京百奥莱博科技有限公司)，充分混合均匀后加入氯仿，振荡，以2 500 r/min离心半径10 cm，离心5 min后取上层无色液体，加入异丙醇充分混合均匀后离心，将上清液弃去，加入焦碳酸二乙酯溶解。②逆转录准备cDNA：参考逆转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)操作说明书进行。③实时荧光定量PCR：参照荧光定量PCR试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)使用说明书，反应条件：95 ℃ 3 min预变性，95 ℃ 30 s变性、58 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸，共完成35个循环，绘制熔解曲线分析PCR产物，每孔设置3个复孔，取3个孔平均值，以GAPDH作为内参基因，以2-ΔΔCt表示相对表达量。LncRNA-CCAT1：上游引物：5′-GCCGTGTTAAGCATTGCGAA-3′，下游引物：5′-AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA-3′。

1.3 预后评价

HBV相关原发性肝细胞癌患者均随访至2021年1月31日，以死亡或随访末为终点，观察患者平均生存期，采用电话、微信、门诊等方式随访。

1.4 观察指标

①观察三组肝功能指标变化；②观察三组血清外泌体LncRNA-CCAT1表达；③采用ROC曲线分析血清外泌体LncRNA-CCAT1对HBV相关原发性肝细胞癌的诊断；④观察HBV相关原发性肝细胞癌预后情况；⑤分析血清外泌体LncRNA-CCAT1与生存相关性。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 三组肝功能变化比较

观察组血清AST和ALT水平高于对照组和正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；且对照组血清AST和ALT水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组肝功能变化比较

2.2 三组LncRNA-CCAT1表达比较

观察组LncRNA-CCAT1表达高于对照组和正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；而对照组和正常组LncRNA-CCAT1表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三组LncRNA-CCAT1表达水平比较

2.3 血清外泌体LncRNA-CCAT1对HBV相关原发性肝细胞癌预测价值

采用ROC曲线分析血清外泌体LncRNA-CCAT1对HBV相关原发性肝细胞癌的预测价值，结果显示，ROC曲线下面积为0.902，最佳截断值为0.814，见图1。

图1 ROC曲线分析LncRNA-CCAT1对HBV相关原发性肝细胞癌的预测价值

2.4 HBV相关原发性肝细胞癌预后情况

所有患者均随访至2021年1月31日，随访12～48个月。平均总生存期为34.52个月(见图2)。

图2 HBV相关原发性肝细胞癌生存分析

2.5 血清外泌体LncRNA-CCAT1与生存时间的

血清外泌体LncRNA-CCAT1与生存呈线性负相关(r=-0.714,P=0.005)。

3 讨论

HBV是原发性肝细胞癌的主要致病病因，高载量的HBV不仅与原发性肝细胞癌的发生、发展关系紧密，且是影响原发性肝细胞治疗效果及预后的关键因素[8-12]。流行病学调查显示，原发性肝细胞癌发病率呈不断上升趋势，位居恶性肿瘤死亡原因的第3位，严重影响人们的生存质量[13]。由于原发性肝细胞癌具有早期诊断困难、恶性程度高、预后差及生存时间等特点，严重威胁患者生命安全[14-16]。因此，提高原发性肝细胞癌的早期诊断率是改善预后及延长患者生存期的有效措施之一。AST和ALT是目前用于诊断HBV及评价肝功能的辅助指标，可反映肝脏内的炎症程度[17]。本文研究表明，观察组和对照组血清AST和ALT水平高于正常组，由此可见HBV相关原发性肝细胞癌患者肝功能明显下降，认为其原因可能是由于HBV相关原发性肝细胞癌当机体感染易感病毒后除乙肝病毒对肝脏的损伤作用外，肝细胞癌对机体特异性免疫同样会对肝功能和肝细胞造成严重损伤。

外泌体可包含微小RNAs、信使RNA和蛋白质，是稳定有效的一种细胞信号传递和交换方式，并且在外泌体的保护下这些内容物不易被降解[17]。LncRNA-CCAT1位于染色体8q24.21 cMyc基因增强子区域。而其中cMyc可通过与LncRNA-CCAT1启动子区域的特定区域结合，促进癌细胞从G1期进入S期，使细胞获得无限增殖能力，且可抑制细胞凋亡[18-19]。近年来，多项研究证实，LncRNA-CCAT1与恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关[20-21]。甘兆义等[22]学者研究报道显示，下调结肠癌细胞中LncRNA-CCAT1表达能够抑制细胞迁移、增殖，且可诱导凋亡。任潇凡等[23]学者研究报道显示，术前收集胰腺癌患者66例与健康体检者66例作为研究对象，胰腺癌患者血清外泌体LncRNA-CCAT1表达明显升高，外泌体LncRNA-CCAT1监测胰腺癌敏感度为89.4%、特异性为87.9%、准确性为89.4%，且血清外泌体LncRNA-CCAT1过表达与不良预后呈正相关，及为影响不良预后独立因素。本文研究表明，观察组LncRNA-CCAT1表达高于对照组和正常组，且与生存呈线性负相关，由此可见HBV相关原发性肝细胞癌患者血清外泌体LncRNA-CCAT1表达明显升高，且与预后密切相关，故而其可作为原发性肝细胞癌诊断及预后评价的有效标志物，但其与原发性肝细胞癌具体发病机制尚不十分明确。

综上所述，血清外泌体LncRNA-CCAT1表达对HBV相关原发性肝细胞癌具有良好诊断价值，可作为早期筛查原发性肝细胞癌的一种新型标志物，且与预后密切相关，具有重要研究价值。