新生儿先天性巨结肠症临床病理特征及CR联合AchE诊断价值分析

王巧鸽，张红丽，赵平

新生儿巨结肠症是小儿较为常见的先天性肠道畸形，其发病机制是因为直肠或结肠远端的肠管持续痉挛，使粪便淤积阻滞在近端结肠，造成肠道肥厚、扩张，也被称作肠管无神经节细胞症[1]。先天性新生儿巨结肠症的临床表现为在出生后的1～6 d内发生急性肠梗阻，且胎便排出延迟，常伴腹胀、呕吐等，对新生儿的生长发育以及生命健康带来极大的威胁。因此如何有效对先天性新生儿巨结肠症作出准确诊断可以为治疗提供便利条件。目前临床常用钡剂灌肠X线片、直肠测压以及病理检查来进行诊断，但当活检部位位于结肠远端可能会对检查结果造成偏差[2-3]。乙酰胆碱酯酶(AchE)是常用的免疫组织化学染色法，其可显示结肠增生的胆碱能纤维，在结直肠相关疾病的诊断上具有较好的效果；钙视网膜蛋白(CR)是一种重要的钙结合蛋白，在含有神经节细胞的肠段均有表达，是一种同时标记神经节细胞及神经纤维的标志物[4-5]。基于此本次研究选择西北妇女儿童医院2020年3月至2020年9月出生的67例新生儿先天性巨结肠症患儿为研究对象，以Kappa值预测模型研究CR、AchE在新生儿先天性巨结肠症病理诊断中的价值，以期为新生儿先天性巨结肠症的诊断提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选择西北妇女儿童医院2020年3月至2020年9月出生的72例疑诊或待除外的新生儿先天性巨结肠症患儿直肠黏膜活检标本，其中男40例，女32例；年龄7～21 d，平均(14.23±2.36)d；体质量(3345.57±346.48)g；胎龄(39.24±3.16)周。临床表现为：出生后均有反复出现腹胀，胎便排出延迟或呕吐，经钡剂灌肠检测提示结肠动力活动性差。所有患儿均行CR染色及AchE染色，以直肠黏膜活检和手术标本根治标本的病理诊断为金标准。经过我院伦理委员会研究批准后实施本次试验，伦理编号2021-022。

1.2 方法

(1)CR染色：将石蜡块5 μm切片，采用En-Vision法进行免疫组织化学染色，将石蜡切片脱蜡水化，以3 min/次使用PBS冲洗3次，加入3%的过氧化氢溶液，在室温下孵育8 min，加入CR并以40 ℃孵育45 min，再加入聚合物增强剂孵育30 min，另外添加酶标抗兔聚合物孵育30 min，加入现配DAB溶液，显微镜下观察后使用自来水冲洗，以苏木精复染使用0.1%盐酸分化，用自来水冲洗返蓝，最后脱水、透明进行封片。

(3) AchE染色：将活检标本8 μm冰冻后切片，使用碘化乙酰胆碱50 mg、1 mL蒸馏水、0.1 mol/L醋酸盐酸冲液6.5 mL、0.1 mol/L枸橼酸钠液、30 mol/L硫酸铜液1 mL和5 mol/L铁氰化钾1 mL现配孵育液进行20 min孵育，再使用双氧水孵育10 min，以苏木精复染使用0.1%盐酸分化，用自来水冲洗返蓝，最后脱水、透明进行封片。

1.3 判断标准

(1)CR染色：当CR染色黏膜下神经丛中神经纤维棕黄色着色即判定为真阳性，黏膜下神经丛中神经纤维出现较少不均匀棕黄色着色即判定为假阳性，黏膜下神经丛中神经纤维出现棕色或黄色即判定为假阴性，黏膜下神经丛中神经纤维无着色即判定为真阴性[6]。

(2)AchE染色：当AchE染色发现黏膜固有层、黏膜肌层出现棕黄色粗大神经纤维即判定为真阳性，出现棕黄色粗大神经纤维但不位于黏膜固有层、黏膜肌层即判定为假阳性，黏膜固有层、黏膜肌层无棕黄色但存在粗大神经纤维即判定为假阴性，黏膜固有层、黏膜肌层无棕黄色粗大神经纤维即判定为真阴性[7]；联合检查中以上任一项检查出现即判定为阴阳情况。

(3)计算方法：特异性=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%，准确率=(真阳性+真阴性)/总例数×100%；阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)×100%，阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)×100%。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 临床病理特征分析

65例患儿中根据直肠黏膜活检和手术标本根治标本的病理诊断确诊为先天性巨结肠患儿57例。CR染色结果显示，阴性表达55例(84.62%)，阳性表达10例(15.38%)，CR阳性反应于正常肠壁黏膜下丛和肌间神经丛，可染色正常神经节细胞和神经纤维，呈棕色表达于细胞核和细胞质；CR阴性表达于先天性巨结肠痉挛段肠壁黏膜下层和肌层，CR阴性表达见图1。AchE染色结果显示阳性53例(81.54%)，阴性12例(18.46%)，AchE染色阳性者可在黏膜固有层看到少量阳性的粗颗粒状结构，见图2。

图1 先天性巨结肠症直肠活检CR染色阳性 图2 先天性巨结肠症直肠活检AchE染色阳性

2.2 CR、AchE单独及联合诊断价值新生儿先天性巨结肠症与病理结果比较

CR染色诊断符合率为90.77%(59/65)，AchE染色诊断符合率为84.62%(55/65)，联合诊断符合率为92.31%(60/65)。具体见表1、2、3。

表1 CR诊断价值新生儿先天性巨结肠症与病理结果比较

表2 AchE诊断价值新生儿先天性巨结肠症与病理结果比较

表3 CR联合AchE诊断价值新生儿先天性巨结肠症与病理结果比较

2.3 CR、AchE单独及联合检测诊断新生儿先天性巨结肠症的价值分析

由表1可见，CR、AchE单独及联合检测诊断新生儿先天性巨结肠症的灵敏度分别为92.98%、87.72%、94.49%，特异度分别为75.00%、62.50%、87.50%，Kappa一致性分别为0.628、0.574、0.759，其中CR、AchE联合检测诊断与手术病理诊断结果一致性较好。

表4 CR、AchE单独及联合检测诊断新生儿先天性巨结肠症的价值分析 (%)

3 讨论

先天性巨结肠是由于肠神经节细胞缺如，是一种常见的先天性肠道畸形，在胚胎6～12周发育过程中，若有病毒感染、代谢紊乱以及胎儿血运障碍等因素，会使神经节细胞变性或神经发育停顿，造成无神经节细胞的肠段出现痉挛、狭窄现象，最终形成巨肠症[8-9]。直肠黏膜活检在临床上常用来诊断先天性巨结肠症，但仍然存在漏诊误诊的发生[10]。新生儿先天性巨结肠症患儿大多数有胎便排除延迟、腹胀腹泻以及呕吐症状，早期症状不明显，随着狭窄段肠道发生继发性扩张，腹胀随之发生，而新生儿先天性巨结肠症病情反复发作，症状持续加重，会造成新生儿营养障碍及生长发育滞后，故应重视新生儿先天性巨结肠症的诊断[11-12]。鉴别诊断主要是与非神经节细胞缺如的便秘疾病鉴别，其中临床症状与新生儿先天性巨结肠症相似，主要表现为便秘、腹胀甚至结肠扩张形成的巨结肠，包括先天性节细胞减少症、肠神经元发育不良。新生儿先天性巨结肠症主要特征是存在误神经节细胞肠段，而其他疾病均没有这个特点。依靠染色进行病理诊断需要丰富的临床病理提升和超高的病理制片技术，不仅要保证取材足够大小和深度符合要求，还要对不成熟的神经节细胞和合并结肠炎的淋巴单核细胞用常规染色法进行鉴别，较容易出现误诊。需要结合免疫组化和酶组织化学染色法进行判断。

有研究指出，免疫组织化学检测CR、AchE在先天性巨结肠症的诊断上有一定的诊断价值[13]。CR是一种重要的钙结合蛋白，在正常结肠黏膜下和肌间神经节细胞和神经从中表达，但在痉挛段肠管不能见到CR阳性显色的神经细胞。相关资料显示，CR可导致胚胎期神经细胞内钙离子缓冲能力下降，进而引起胚胎内细胞损伤，与先天性巨结肠发病有关。AchE存在于胆碱能神经纤维，AchE阳性神经在正常人肠壁黏膜的固有膜内无法显示，AchE染色可使肠壁黏膜的固有膜内AchE阳性神经显示，故AchE染色在先天性巨结肠诊断方面具有一定临床价值。因此本次研究以Kappa值预测模型研究CR、AchE在新生儿先天性巨结肠症病理诊断中的价值，观察其染色变化，在新生儿先天性巨结肠症的诊断上有着积极意义。结果显示，CR阳性反应于正常肠壁黏膜下丛和肌间神经丛，可染色正常神经节细胞和神经纤维，呈棕色表达于细胞核和细胞质；CR阴性表达于先天性巨结肠痉挛段肠壁黏膜下层和肌层；AchE染色阳性者可在黏膜固有层看到少量阳性的粗颗粒状结构。

另外本次研究发现单CR、AchE染色及CR联合AchE染色诊断新生儿先天性巨结肠症的价值进行分析，发现CR、AchE染色单独及联合诊断先天性巨结肠Kappa一致性分别为0.628、0.574、0.759，其中CR、AchE联合检测诊断与手术病理诊断结果一致性较好，提示联合诊断能提升诊断价值。AchE染色是临床上研究较多的一种诊断先天性巨结肠症的手段，在新生儿先天性巨结肠症患儿病变肠段中AchE活性会异常升高，继而显色反应会呈现出神经纤维大量赠生，即可诊断为新生儿先天性巨结肠症，而由于神经节细胞的缺失，副交感神经节前纤维无法与神经节细胞形成触突，继而副交感神经会进入肠壁，乙酰胆碱的特异度会因此增高，成为AchE染色诊断先天性巨结肠症的优势[14]。但有研究指出AchE染色的敏感性不佳，会产生大量假阴性结果，由于AchE具有较高的渗透性，可以同时存在胆碱能神经元和非胆碱能神经元，故会造成较高的假阳性。CR作为重要的钙结合蛋白之一，可在Ca2+浓度升高时减轻细胞损伤，可以发挥保护神经的功效。CR染色可在正常肠段中对神经元以及神经纤维中染色，在痉挛病变肠段无法对神经节细胞着色，且在神经纤维的染色情况与正常肠段比较也大有不同，故可作为诊断先天性巨结肠症的手段[15-16]。但对于黏膜固有层表达其连续性较差，更多表现在黏膜下神经节细胞和神经纤维中，在黏膜下呈现弱阳性，从而加大诊断的难度，而且在标本取材上有着严格要求，切片过浅无法获得较好的着色呈现。CR主要集中表达在中枢神经和外周神经系统，在正常结肠黏膜下和肌间神经节细胞和神经丛也有表达，在无神经节细胞的狭窄短结肠不表达[17]。CR染色可减轻AchE染色潜在的毒性，减少诊断假阴性结构，而AchE染色可在取材检查方面提供便利条件，故笔者建议应行CR联合AchE染色诊断新生儿先天性巨结肠症，同时新生儿先天性巨结肠症病情复杂，在鉴别时应密切关注新生儿先天性巨结肠症的病理性质，以提高诊断的准确性[18]。

在本次研究中也存在以下不足：①新生儿期的神经节细胞尚未发育成熟，其结构缺乏典型性；②活检部位为较远较短的肠断；③研究时间短、区域覆盖范围小以及纳入病例小等。以上均会对研究所得结论造成影响，因此后期还需花费更多时间和精力去完善所得结论。④没有纳入影像学检查及肛门直肠测压检测结果，使得本诊断结果缺少必要的数据支持，影响了其应用机制。

综上所述，CR联合AchE染色诊断新生儿先天性巨结肠症有着较为准确的诊断率，可有效减少误诊率，临床应当重视。