胰蛋白酶原在急性胰腺炎中的研究进展

罗玉亭，王秀日，李精伟，张淑娥，吕志武,2

【提要】 急性胰腺炎是胰蛋白酶原在腺泡内提前激活所引起的胰腺自我消化性疾病，以腺泡细胞损伤、局部及全身炎症反应为主要特征。腺泡细胞内胰蛋白酶原异常激活是急性胰腺炎初始事件，与急性胰腺炎发生密切相关，而炎症级联反应在疾病进展中发挥重要作用。通过回顾近年关于急性胰腺炎的细胞生物学、遗传病学研究，本综述讨论了胰蛋白酶原激活途径以及胰蛋白酶原激活的下游事件。

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常见的消化系统疾病之一，大多数急性胰腺炎患者病情较轻且具有一定的自限性，但仍有20%的急性胰腺炎患者发展为重症急性胰腺炎，出现全身炎症反应综合征、器官功能衰竭等严重并发症[1,2]。在动物模型以及临床患者标本中，可以观察到胰蛋白酶原在急性胰腺炎早期阶段激活，胰蛋白酶具有消化酶特性(分解有机物)且能够引起其他消化酶级联反应性激活，因而急性胰腺炎发生与胰蛋白酶原提前异常激活密切相关[3]。在急性胰腺炎患者的血液和尿液中，可以检测出胰蛋白酶原和胰蛋白酶原激活肽(trypsinogen activation peptide，TAP)的升高[4]。另外，常染色体显性遗传性胰腺炎与人类阳离子胰蛋白酶原基因突变相关，而且大多数胰腺炎遗传危险因素涉及到消化酶或消化酶抑制剂的改变，进一步支持了胰蛋白酶在急性胰腺炎发生发展的作用[5,6]。尽管经历了数十年的研究，急性胰腺炎确切的发病机制尚未完全阐明，目前尚未有针对急性胰腺炎的特效治疗药物。近年来，关于急性胰腺炎发病机制的研究有了新的进展，本综述通过回顾近年急性胰腺炎细胞生物学、遗传学的相关研究，旨在讨论胰蛋白酶原激活途径以及胰蛋白酶活化的下游事件。

1 胰蛋白酶原的生理性激活机制

在生理状态下，胰蛋白酶以无活性的酶原形式集中储存在胰腺腺泡细胞顶端区域，而胰蛋白酶原激活发生在肠道中。在生理性胆囊收缩素以及副交感神经释放的乙酰胆碱刺激下，钙离子作为第二信使介导细胞内信号传导，酶原颗粒与顶端细胞质膜胞吐融合并且释放出胰蛋白酶原，胰蛋白酶原随着胰液通过胰管系统被输送到肠道[7]。胰液分泌到十二指肠后，小肠刷状缘上的肠激酶激活胰蛋白酶原，活化的胰蛋白酶进而引起其他消化酶级联反应性激活[5]。

2 胰蛋白酶原的病理性激活机制

2.1 胰蛋白酶原自激活

急性胰腺炎的发生发展受遗传、代谢、环境等多因素共同影响，其中遗传突变可能加重和放大环境因素的影响。人类胰腺中含量最丰富的胰蛋白酶原亚型是阳离子胰蛋白酶原和阴离子胰蛋白酶原，分别由PRSS1基因和PRSS2基因编码。功能获得性PRSS1基因突变，通过促进胰蛋白酶原自激活来增加胰蛋白酶活性，与人类遗传性胰腺炎密切相关。研究发现，PRSS1基因突变主要改变了乳糜酶C(chymotrypsin C，CTRC)敏感性切割位点和胰蛋白酶调节切割位点，进而增强胰蛋白酶原自我激活能力以及胰蛋白酶原抵抗CTRC降解的能力[6]。CTRC对胰蛋白酶原的作用分为两个方面，一方面通过对胰蛋白酶原激活肽的加工来增强胰蛋白酶原自激活能力，另一方面通过裂解胰蛋白酶原的钙结合位点来促进胰蛋白酶原的降解[8]。人类阳离子胰蛋白酶原分子结构的改变，会影响CTRC的作用效果。正常情况下，CTRC以降解胰蛋白酶原为主，当胰蛋白酶原N末端或激活肽发生改变时，情况则截然相反[6]。与野生型小鼠和PRSS1WT转基因型小鼠对比，PRSS1R122H转基因突变型小鼠自发性出现以腺泡细胞凋亡、炎症细胞浸润增加为特征的局灶性胰腺损伤，并且在病理性刺激下出现更严重的胰腺炎[9]。与遗传性胰腺炎相关的基因突变使胰蛋白酶活性升高，增加了胰腺对环境损伤因素的敏感性，也增加了发展为严重胰腺炎的风险[9, 10]。另外，胰蛋白酶原自激活能力增强，还可能与防御胰蛋白酶原自我激活的保护性机制受损相关，包括与乳糜酶C功能缺失(降解胰蛋白酶功能缺失)相关的CTRC突变、与胰蛋白酶抑制剂功能缺失相关的SPINK1突变[6, 11]。

目前尚未发现PRSS2突变与遗传性胰腺炎相关，阴离子胰蛋白酶原虽然具有同样强烈的自我激活倾向，但是阴离子胰蛋白酶原比阳离子胰蛋白酶原更易受CTRC影响，CTRC能更有效地降解阴离子胰蛋白酶原[6]。

2.2 组织蛋白酶

组织蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)是一种溶酶体水解酶，是迄今为止已知的最有效的细胞内胰蛋白酶原激活剂。体内外实验研究表明CTSB能够直接激活胰蛋白酶原， CTSB基因敲除或药理性抑制CTSB均能降低胰蛋白酶活性以及胰腺炎严重程度[5, 12, 13]。长期以来认为，急性胰腺炎的发生始于酶原颗粒与溶酶体共定位，两者共定位后组织蛋白酶B激活胰蛋白酶原，进而导致腺泡细胞损伤[14]。但是新研究表明，组织蛋白酶B与胰蛋白酶原共定位在正常生理状态下已发生，但是细胞内中性pH环境以及组织蛋白酶L(组织蛋白酶L能够介导胰蛋白酶原降解)可以拮抗CTSB对胰蛋白酶原的激活作用，胰蛋白酶原的激活以及胰蛋白酶的降解处于平衡状态。急性胰腺炎发生时，组织蛋白酶B活性增加以及胞内酸性环境将破坏上述平衡，胰蛋白酶原的激活大于胰蛋白酶的降解[12]。在急性胰腺炎发生过程中，巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞迁移至胰腺组织，其中以巨噬细胞为主，近年研究发现胰蛋白酶原的活化不仅发生在胰腺腺泡细胞内，也发生在巨噬细胞中[2, 15]。巨噬细胞胰蛋白酶原的激活同样对胞内pH环境敏感，同时还涉及巨噬细胞对腺泡细胞组分的吞噬作用(其中也包括对酶原颗粒的吞噬作用)、组织蛋白酶B的表达与活化[2]。胰蛋白酶原在巨噬细胞内激活对急性胰腺炎发展发挥重要作用。

与组织蛋白酶B及组织蛋白酶L不同，组织蛋白酶D并非直接作用于胰蛋白酶(原)而是通过激活组织蛋白酶B来引起腺泡细胞损伤的，组织蛋白酶D基因敲除显著降低了组织蛋白酶B及胰蛋白酶的活性[5]。

2.3 钙超载

许多生理过程与胞内短暂的、有限的Ca2+浓度升高相关，而长期持续性Ca2+浓度升高(钙超载)是引起细胞受损的常见病理生理机制[16]。钙超载与急性胰腺炎的发生发展密切相关，胞质内持续性高钙水平是触发急性胰腺炎的关键因素。病理性刺激通过IP3Rs 和 RyRs触发细胞钙池(内质网)Ca2+释放，钙池内钙消耗进而引起质膜上钙池调控钙内流(store operated Ca2+entry，SOCE)，大量钙离子由胞外向胞内流入。长期持续性高钙反应将导致酶原颗粒不稳定、细胞空泡化，进而引起另一个钙依赖性反应，即胞内胰蛋白酶原的激活[1, 16, 17]。阻断钙信号通路可以降低胰蛋白酶活性，可能是治疗急性胰腺炎的一个策略。Oria钙通道抑制剂介导SOCE阻断，可以降低啮齿动物和人类腺泡中胰蛋白酶原激活、腺泡细胞死亡以及全身炎症反应，即使在低剂量CM4620下也能使实验大鼠胰腺内的胰蛋白酶活性降低70%左右[16]。另外，抑制IP3Rs以及应用钙耦合剂同样能降低胰蛋白酶活性，对急性胰腺炎起保护性作用[18]。值得注意的是，部分电压门控型钙离子通道抑制剂(如尼莫地平、维拉帕米)对急性胰腺炎的影响截然相反，这是由于这部分钙离子通道抑制剂能够通过激活组织蛋白酶B来提高胰蛋白酶的活性[19]。

急性胰腺炎常见病因包括胆道梗阻、大量饮酒、内镜逆行性胰胆管造影术等。近年临床研究发现，吸烟是急性胰腺炎的独立危险因素，吸烟和急性胰腺炎之间存着剂量依赖性关系[20]。进一步实验研究表明，尼古丁的衍生物4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK)可以通过烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors，nAChR)介导细胞内胰蛋白酶原提前激活，阻断nAChR能降低胰蛋白酶原活化水平[21]。另一个研究中，α7nAChR基因敲除对NNK诱导的急性胰腺炎具有保护作用，α7nAChR是钙离子通道受体，钙信号作为α7nAChR激活的下游靶点参与酶原激活，无钙培养或钙螯合剂处理后NNK介导的胰蛋白酶原激活也减弱[22]。

2.4 自噬受损

在自噬过程中，溶酶体将受损或功能失调的细胞器、长寿蛋白质等有害成分进行分解代谢，自噬对维持细胞稳态至关重要[23]。自噬在胰腺中的生理作用与隔离降解受损的酶原颗粒相关，基础自噬作为有效的保护机制在预防急性胰腺炎方面发挥重要作用[24]。自噬可降解活化的酶原颗粒，避免消化酶释放到细胞质中，从而防止消化酶级联反应和细胞死亡[25]。溶酶体相关膜蛋白(lysosome associated membrane proteins，LAMPs)对维持溶酶体功能至关重要，LAMP-2缺失型小鼠可出现自发性胰腺炎[26]。Atg7基因编码一种重要的自噬相关性蛋白，Atg7缺失型小鼠在4周龄时开始自发性出现酶原颗粒增多，并且同时出现胰腺炎特征，由此可推测，酶原颗粒积累可能是自噬受损诱发胰腺炎的关键环节[27]。LC3Ⅱ是成熟自噬体标记物，其升高反应自噬通量的增加或自噬受阻。p62是一种泛素结合蛋白，在自噬过程中被自噬溶酶体降解，间接反映自噬体清除水平。细胞内LC3Ⅱ、p62同时升高表示细胞内自噬受损[26]。急性胰腺炎相关性病理刺激可以激活腺泡细胞自噬，但是自噬的完成受阻，出现LC3Ⅱ、p62的积累。在体外催化实验中，胰蛋白酶的活性随着LC3Ⅱ、p62水平的增高而增高，进一步表明自噬受损可促进胰蛋白酶原激活[1]。最近一个研究实时监测胰蛋白酶活性变化，病理性刺激早期阶段，在无自噬体和溶酶体标志物的囊泡中，可以检测到活跃的胰蛋白酶活性，提示胰蛋白酶原激活先于自噬体的形成，因而自噬可能是在疾病稍后阶段调整胰蛋白酶整体活性[13]。

2.5 其他影响因素

中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NET)是中性粒细胞受到血液或组织病原体激活后所释放的胞外网状结构，主要由DNA、组蛋白以及颗粒蛋白组成。在重症急性胰腺炎患者和急性胰腺炎动物模型中，血浆NET明显升高，NET在急性胰腺炎进展过程中发挥重要作用[28]。NET通过组蛋白介导胰蛋白酶原激活，NET诱导的腺泡细胞胰蛋白酶活化程度与雨蛙素诱导的胰蛋白酶活化程度相当[29]。此外，低pH环境、氧化应激、线粒体功能障碍和内质网应激也能影响胰蛋白酶活性，它们可能通过直接或间接方式激活胰蛋白酶原[8]。

3 胰蛋白酶原激活与腺泡细胞死亡

PRSS1R122H基因突变与人类遗传性胰腺炎密切相关，PRSS1R122H小鼠自发性出现伴有细胞凋亡的局灶性胰腺损伤[9]。胰蛋白酶原-7(trypsinogen-7，T7)是小鼠胰蛋白酶原的主要亚型，小鼠T7D23A突变使胰蛋白酶原自激活增强50倍，3周龄时T7D23A突变型小鼠开始出现以水肿、小叶中央坏死以及大量炎细胞浸润为特征的自发性急性胰腺炎[15]。胰蛋白酶原-7基因敲除型小鼠(T7-KO)消除了胰蛋白酶原激活，在超剂量雨蛙素刺激下，T7-KO型小鼠比野生型小鼠的细胞坏死程度减少一半[30]。以上动物实验均表明，在急性胰腺炎早期阶段胞内胰蛋白酶原激活将导致细胞死亡，但是胰蛋白酶诱导腺泡细胞死亡的具体机制仍有争议。病理性刺激下，胰腺腺泡细胞发生空泡化，胞内形成巨大的胰蛋白酶囊泡，膜包裹的胰蛋白酶是无害的直至囊泡破裂。消化酶逃逸到细胞质或细胞外液后，蛋白成分急剧降解，于囊泡破裂30分钟以内细胞发生死亡[7]。类似于消化食物一样，漏入细胞质的胰蛋白酶及其他消化酶消化水解胞质有机成分进而引起细胞损伤，另外受损的细胞释放各种炎症介质引起炎症细胞浸润，进一步加重细胞死亡[12]。但是有研究表明，触发细胞死亡途径的因素不是胰蛋白酶而是组织蛋白酶B，胰蛋白酶是通过介导CTSB释放而间接导致细胞死亡的。胰蛋白酶的活化引起共定位细胞器膜不稳定，CTSB从共定位室腔漏入细胞质，小剂量CTSB通过裂解bid蛋白和激活bax蛋白来触发腺泡细胞调亡的内在途径，而大剂量CTSB将诱导腺泡细胞坏死[14]。最新研究表明CTSB还能通过激活caspase-1促进细胞焦亡，抑制CTSB可减少腺泡细胞死亡[31]。另外，活化的胰蛋白酶也可能通过内质网应激增加、DNA氧化性损伤、DNA损伤信号上调和p53介导的细胞凋亡机制来引起胰腺腺泡细胞死亡[10]。

4 胰蛋白酶原激活与炎症反应

胞内胰蛋白酶原异常激活是急性胰腺炎初始事件，细胞损伤后触发炎症反应，疾病进展情况可能取决于炎症放大或消退。细胞因子和炎症介质可以引起血管通透性增加、微循环紊乱和凝血功能异常等病理生理变化，进而加重胰腺损伤并加速疾病恶化[8]。

胰蛋白酶原的激活可以通过直接或间接方式启动炎症级联反应。活化的胰蛋白酶导致腺泡细胞损伤，直接诱导腺泡细胞释放促炎介质和趋化因子，进而参与免疫细胞激活以及白细胞募集，而炎症反应的激活反过来也加重了胰腺损伤[2]。腺泡细胞损伤与炎症反应之间形成因果循环，互相促进。胰蛋白酶原在激活过程中释放出TAP，TAP可诱导腺泡细胞内高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-l，HMGB1)的释放(即早期炎症因子诱导晚期炎症因子)，进一步促进急性胰腺炎发展[32, 33]。TAP浓度反映了胰蛋白酶原激活程度，临床研究证实了血尿TAP浓度与急性胰腺炎严重程度密切相关[4, 32]。巨噬细胞在吞噬受损腺泡细胞时也吞噬了酶原颗粒，巨噬细胞中胰蛋白酶原活化可以直接诱导NF-κB易位和炎症细胞因子产生，因而导致胰腺炎加重和全身炎症反应[2]。在急性胰腺炎发生发展过程中，胰蛋白酶活性升高遵循双相模式，疾病早期胰蛋白酶活性升高主要源于腺泡细胞内胰蛋白酶原的激活，第二个高峰可能源于巨噬细胞内胰蛋白酶原的激活，而后者是影响炎症反应和疾病严重程度的关键，靶向性抑制巨噬细胞胰蛋白酶原激活可能是治疗重症胰腺炎的一个方向[2]。

通过转基因技术，可以增加小鼠胰蛋白酶原的自激活。在病理性刺激下，转基因突变型小鼠比野生型小鼠的胰蛋白酶活性更高，并且浸润的炎症细胞更多，胰蛋白酶活化程度与疾病严重程度呈正相关关系[3]。但是在另一个研究中，小鼠胰蛋白酶原-7基因的敲除仅部分降低胰腺坏死程度，而且对缓解局部及全身炎症反应没有影响[30]。由此可见，胰蛋白酶原的激活仅是急性胰腺炎的驱动因素之一，胰蛋白酶活性升高可以促进炎症反应和疾病进展，但是炎症反应不完全取决于胰蛋白酶原的激活，还存着其他因素直接触发和驱动炎症反应。另外还有研究表明胰蛋白酶原异常激活与炎症信号通路都是急性胰腺炎早期事件，两者都能触发急性胰腺炎，其中NF-κB激活与胰酶异常激活可能是并联事件[8, 34]。

5 总结与展望

目前急性胰腺炎尚无特效治疗药物，重症急性胰腺炎具有较高死亡率。胰蛋白酶原提前激活是急性胰腺炎初始事件，本综述讨论了胰蛋白酶原激活途径，包括胰蛋白酶原自激活、钙超载、组织蛋白酶B、自噬受损、中性粒细胞胞外陷阱等，为急性胰腺炎新型治疗方向提供思路。胰蛋白酶活性异常升高可导致腺泡细胞死亡并且促进炎症反应，但是还可能存在其他因素(比如钙超载)直接触发和促进炎症反应，蛋白酶原异常激活与炎症信号通路可以是急性胰腺炎的并联事件。未来还需要进一步研究探讨不同类型急性胰腺炎发生发展的主导驱动因素，使急性胰腺炎的治疗更具有针对性。