血清PTEN、BMP-9水平与胫骨平台骨折术后愈合延迟的关系

任伟民，李佳，舒文，陈凯，黄劲东

柳州市人民医院创伤骨科烧伤科，广西柳州 545000

胫骨平台骨折是外力作用下导致的胫骨平台骨质连续性中断，占临床成人所有骨折的1%，年轻患者多由高能量创伤（道路交通事故）导致胫骨近端轴向和（或）扭转力增加引起，老年人多由低能量创伤（跌倒）导致脆性骨折［1］。手术是治疗胫骨平台骨折的主流方法，骨折愈合延迟是术后常见并发症，影响术后肢体功能恢复，降低生活质量，导致严重残疾。现有研究显示，炎症细胞、干细胞、成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞、内皮细胞以及细胞因子和生长因子之间复杂协调参与骨折愈合过程，与骨折后不愈合有密切关系［2］。第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因（PTEN）是细胞生长/存活以及新陈代谢的关键调节剂，并参与骨髓间充质干细胞成骨分化过程［3］。骨形成蛋白-9（BMP-9）是促使关节软骨祖细胞形成软骨细胞的调节因子，可诱导软骨形态发生［4］。PTEN、BMP-9 与胫骨平台骨折术后延迟愈合是否有关尚不清楚。本研究拟检测胫骨平台骨折患者血清PTEN、BMP-9水平，分析其在骨折愈合过程中的作用和意义，以期为临床病情评估和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019年6月—2021年1月本院收治的129例的胫骨平台骨折患者，纳入标准：①术前X线片、MRI检查诊断为胫骨平台骨折；②具备手术指征，均行内固定手术治疗；③年龄18岁以上；④患者或其家属知情同意并签署同意书。排除标准：①骨肿瘤、骨结核、骨代谢异常；②多发骨折，合并严重颅脑创伤患者；③合并其他系统恶性肿瘤；④未能定期复诊和接受随访者。所有患者术后定期复诊，接受X线片检查，以骨折后3 个月X 线检查示无或极少骨痂生成，断端骨质可见硬化、间隙为骨折愈合延迟［5］，根据是否发生骨折愈合延迟分为延迟愈合组（19例）和正常愈合组（110例）。本研究获我院伦理委员会批准（20190641）。

1.2 临床基线资料收集 记录患者年龄、性别、骨折类型、损伤原因、骨质疏松、合并疾病、手术方式、术后负重时间、术后负重延迟、术后并发症（局部感染、筋膜室综合征）等。骨质疏松按照2017 版《原发性骨质疏松症诊疗指南》［6］，将术后开始负重时间超过12周定义为术后负重延迟［7］。

1.3 血清PTEN、BMP-9水平检测 分别于术前、术后1、2、4周采集静脉血3 mL注入干燥试管待血液凝固后取上层液离心（4 ℃，3 000 r/min，离心15 min，离心半径10 cm），取血清-70 ℃保存。室温下复融血清标本，SpectraMax iD5-多功能酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）采用酶联免疫吸附试验检测血清BMP-9 水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。实时荧光定量聚合酶链反应检测血清PTEN mRNA 表达，取血清样本，加入TRIzol™plus RNA Purification Kit（美国Invitrogen 公司）提取总 RNA，M-MLV 逆转录酶（美国Promega 公司）反转录为cDNA。StepOnePlus™实时荧光定量PCR 系统（美国赛默飞 Applied Biosystems）进行 qRT-PCR 分析，2-ΔΔCt法计算PTEN mRNA 相对表达。PTEN mRNA 正向引物：5'-TCCCAGACATGACAGCCATC-3'，反向引物：5'-TGCTTTGAATCCAAAAACCTTACT-3'；β-actin（内参）正向引物：5'-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3'，反向引物：5'-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3'。反应体系，DNA 模板2 µL，正反向引物各1 µL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 µL，RNase-Free ddH2O 21 µL。反应条件：95 ℃预变性3 min循环1次；98 ℃变性2 s、67 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s，循环30次。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料符合正态分布以表示，采用单因素方差分析（两两比较采用LSD-t检验）或独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。多因素Logistic 回归分析胫骨平台骨折术后愈合延迟的相关因素，受试者工作特征（ROC）曲线分析PTEN mRNA、BMP-9 预测胫骨平台骨折术后愈合延迟的价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 延迟愈合组和正常愈合组基线资料比较 延迟愈合组年龄、骨质疏松、糖尿病、延迟负重比例、术后并发局部感染、术后并发筋膜室综合征比例高于正常愈合组（P均＜0.05），术后完全负重时间长于正常愈合组（P＜0.05），其余指标比较差异无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1 延迟愈合组和正常愈合组基线资料比较

2.2 两组血清PTEN mRNA、BMP-9 水平比较 两组手术前后血清PTEN mRNA、BMP-9水平差异有统计学 意义（F组间分别为 16.352、103.261，P均＜0.05），PTEN mRNA、BMP-9呈逐渐增高趋势（F时间分别 为 10.541、32.721，P均 ＜0.05），两 组 PTEN mRNA、BMP-9 存在交互效应（F交互分别为 6.251、12.354，P＜0.05）。术前血清 PTEN mRNA、BMP-9比较差异无统计学意义（P均＞0.05），延迟愈合组术后 1、2、4 周血清PTEN mRNA、BMP-9 均低于正常愈合组（P均＜0.05），见表2。

表2 两组血清PTEN mRNA、BMP-9水平比较（）

表2 两组血清PTEN mRNA、BMP-9水平比较（）

注：与正常愈合组同期比较，aP＜0.05。

组别延迟愈合组术前术后1周术后2周术后4周正常愈合组术前术后1周术后2周术后4周n PTEN mRNA BMP-9（ng/mL）19 0.65±0.19 0.85±0.25a 1.03±0.33a 1.69±0.41a 0.32±0.05 0.41±0.11a 0.49±0.16a 0.53±0.19a 110 0.30±0.06 0.95±0.29 1.95±0.52 2.35±0.61 0.64±0.13 1.86±0.21 2.05±0.35 3.11±0.59

2.3 影响胫骨平台骨折患者术后延迟愈合的因素 以年龄、骨质疏松、糖尿病、负重延迟、术后并发局部感染、术后并发筋膜室综合征、术后完全负重时间、PTEN mRNA、BMP-9 为自变量，以胫骨平台骨折患者术后是否发生延迟愈合（赋值：0=否，1=是）为因变量，ENTER 法筛选变量，最终骨质疏松、术后4 周PTEN mRNA、术后4 周BMP-9 与胫骨平台骨折患者术后延迟愈合有关（P均＜0.05），见表3。

表3 影响胫骨平台骨折患者术后延迟愈合因素的Logistic回归分析

2.4 PTEN mRNA、BMP-9 预测胫骨平台骨折术后愈合延迟的价值 术后4 周，PTEN mRNA、BMP-9预测胫骨平台骨折术后愈合延迟的曲线下面积分别为0.752、0.726，联合（基于Logistic 回归）预测的曲线下面积为0.923，高于单独指标预测（Z分别为3.105、3.273，P＜0.05），见表4。

表4 PTEN mRNA、BMP-9预测胫骨平台骨折术后愈合延迟的效能

3 讨论

胫骨平台是膝关节远半部分的骨平台，由被髁间隆起隔开的内侧和外侧髁组成，胫骨平台骨折通常表现为脆性骨折或高能量损伤，后者多伴广泛软组织损伤，危及生命和肢体功能的并发症。良好的解剖复位、稳定内固定可促进骨愈合并降低外伤性骨关节炎的风险，但是即便接受同样手术方式治疗，仍有少数患者术后发生愈合延迟甚至不愈合，据统计胫骨平台骨折术后不愈合或延迟愈合的发生率在22%以内［8］。骨折愈合多发生在术后 3～6 个月，骨折延迟愈合可增加再次骨折风险，导致严重残疾，探寻与骨折延迟愈合的因素和生物学指标十分重要。现有研究显示骨折延迟愈合与年龄、营养状态、血流变以及成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等多种细胞因子有关，各类细胞因子相互作用参与骨折愈合过程［2］。

PTEN是一种经典的肿瘤抑制因子，位于人类染色体10q23，具有蛋白质和脂质磷酸酶活性。PTEN通过负向调控磷脂酰肌醇3-磷酸激酶（PI3K）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路参与细胞生长、存活、迁移和分化等生理过程，PTEN 还可调节葡萄糖代谢、脂质代谢、线粒体代谢。PTEN 缺失可导致脂肪变性建立促进肿瘤的环境，与恶性肿瘤发生密切相关［9］。超过一半的骨肉瘤组织中PTEN 表达缺失或呈低表达，PTEN 低表达与骨肉瘤晚病理分期以及较差预后有关［10］。本研究发现，PTEN mRNA与胫骨平台骨折术后愈合延迟存在密切关系，延迟愈合组血清PTEN mRNA 表达低于正常愈合组，表明PTEN mRNA 缺乏与骨折愈合延迟有关。现有研究显示，PTEN 通过调控PI3K/Akt信号通路增加缺氧诱导因子1α 和磷酸化-Akt 活性，增强骨髓源性干细胞成骨分化，促使新骨形成，上调PTEN 活性可抑制核因子-κB 受体激活剂配体诱导的核因子-κB 和 Akt 信号通路，继而抑制破骨细胞生成和骨吸收［11］。说明PTEN 具有促使成骨分化作用，PTEN 缺失可能抑制成骨分化，导致新骨形成减少，继而引起骨折后愈合缓慢。SHEN 等［12］报道指出，PTEN 活化可促使间充质干细胞成骨分化，支持本研究结论。

BMP-9 是骨诱导生长因子之一，属于转化生长因子β 超家族，具有调节淋巴管内皮细胞增殖和内皮细胞可塑性，软骨细胞和成骨细胞的生长和分化，诱导骨和软骨形成和骨折修复作用［13］。BMP-9可刺激脂肪细胞来源的间充质祖细胞成骨，并表现出显著的成骨特性［14］。在骨折愈合过程中，BMP-9 可上调RUNX2和COL-1表达，增加骨质疏松骨折大鼠骨量和强度，介导骨痂形成，维持骨折部位早期机械稳定性［15］。本研究发现，胫骨平台骨折后延迟愈合与血清BMP-9 水平降低有关，说明BMP-9 缺乏可能导致胫骨平台骨折后骨折愈合过程延迟，是预测骨折延迟愈合的生物学指标。可能机制：首先，Orai1 具有介导间充质干细胞成骨的潜能，在成骨条件下，Orai1 通过骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白信号通路介导成骨分化［16］。BMP-9 可调控 Orai1 信号途径，参与间充质干细胞骨向分化过程［17］，因此推测BMP-9 可能通过调控Orai1 途径促进骨折后骨质成骨分化和新骨形成过程。其次，BMP-9 通过增加Akt1/2 磷酸化，增强碱性磷酸酶活性，促进骨桥素、骨钙素表达以及钙盐沉积，诱导骨形成［18］。

ROC 曲线分析结果显示，术后4 周PTEN mRNA、BMP-9 预测胫骨平台骨折术后延迟愈合均具有一定效能，联合检测的预测效能明显提高，临床可通过检测血清PTEN mRNA、BMP-9水平评估术后延迟愈合风险，提出针对性干预措施，改善临床结局。回归分析结果显示，骨质疏松同样影响胫骨平台骨折术后愈合过程，分析原因为骨质疏松患者骨密度降低，骨量减少，骨形成能力减弱，导致骨折愈合缓慢甚至不愈合［6］。

综上所述，胫骨平台骨折术后延迟愈合患者血清PTEN mRNA、BMP-9 水平均降低，低水平PTEN mRNA、BMP-9 是骨折术后延迟愈合的危险因素之一，检测血清PTEN mRNA、BMP-9 水平有助于预测骨折延迟愈合，从而进行针对性干预，促使骨折愈合。本研究不足之处在于观测时间过短，PTEN mRNA、BMP-9 在骨折愈合过程中的变化特点尚待进一步探讨。