血清miR-124-3p、miR-143-3p 与老年全身麻醉患者围术期神经认知紊乱的相关性

霍奇帆，张玉明，赵静，郭建伟

陕西省人民医院麻醉科，西安 710068

围术期神经认知紊乱（PND）包括急性谵妄和长期术后认知功能障碍，随着世界人口老龄化和医疗卫生技术的进步，接受麻醉和手术的老年患者越来越多，PND 发病率不断增高，其不仅影响术后康复，还可增加痴呆发生甚至死亡风险［1］。微小核糖核酸（miRNA）属于非编码RNA，通过与信使RNA 的3'-非翻译区结合调控基因表达，在神经再生和神经元凋亡调节中起重要作用，miRNA 表达异常与认知功能障碍存在密切关系［2］。miR-124-3p 是神经元特异性miRNA。动物研究显示，其在创伤后脑小胶质细胞中表达上调，可促使神经元存活，β 淀粉样蛋白沉积，减轻创伤导致的神经变性以及认知功能受损［3］。miR-143-3p 是一种多功能 miRNA，临床研究显示，阿尔茨海默病患者血清miR-143-3p 水平上调，且其水平与脑脊液中磷酸化Tau/β 淀粉样蛋白42 水平相关［4］。miR-124-3p、miR-143-3p 是否与老年全身麻醉患者PND 有关尚不清楚，目前报道少见。近年来，我们检测了全身麻醉患者血清miR-124-3p、miR-143-3p水平，分析其与PND的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2019 年 2 月—2021 年 2 月于本院拟行全身麻醉手术的103例老年患者。纳入标准：①年龄＞60 岁；②具备手术指征，无麻醉禁忌；③小学以上文化教育程度，术前无认知功能障碍。排除标准：①既往精神疾病、脑血管疾病、帕金森病、阿尔茨海默病者；②术中输血者；③嗜酒、酒精性脂肪肝、贫血、高钠和低钠血症者。PND 诊断标准：术后住院期间中文版蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评分或简易智能精神状态检查量表（MMSE）评分降低，＜26 分［5］，根据是否发生 PND 将患者分为 PND 组（28例）和 NPND 组（75例）。PND 组：男 19例、女 9例，年龄 62～77（69.35 ± 3.45）岁，文化教育年限6～14 年。NPND 组：男 49例、女 26例，年龄 61～75（66.77 ± 3.09）岁，文化教育年限6～17 年。PND 组年龄大于 NPND 组（P＜0.05），文化教育年限低于NPND 组（P＜0.05），两组性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究获得医院伦理委员会批准（2019-0612），所有受试者知情同意并签署同意书。

1.2 麻醉方法 所有患者给予全凭静脉麻醉，咪达唑仑0.05 mg/kg、丙泊酚1～2 mg/kg、舒芬太尼0.5～1 µg/kg、罗库溴铵 0.6～0.9 mg/kg 静脉注射诱导麻醉，麻醉起效后气管插管麻醉呼吸机控制呼吸。丙泊酚6～8 mg/（kg·min）、瑞芬太尼0.1～0.5 µg/（kg·min）持续静脉泵入，间断注入罗库溴铵维持麻醉。术后给予静脉自控镇痛，枸橼酸舒芬太尼注射液2µg/kg+盐酸托烷司琼注射液15 mg+生理盐水共100 mL，背景剂量2 mL/h，负荷剂量3 mL，单次追加给药剂量0.5 mL/次，锁定时间15 min，术后持续应用48 h。

1.3 血清miR-124-3p、miR-143-3p检测 分别于术前（T0）、术后 1 d（T1）、术后 3 d（T2）、术后7 d（T3）采集空腹静脉血5 mL，取上清液置于TGL-15M 台式微量高速冷冻离心机（湖南平凡科技有限公司），4 ℃下3 000 r/min离心15 min（离心半径10 cm），取血清-80 ℃保存待检。使用TRIzol 法提取分离总RNA，Nano-Drop 2000 分光光度计（Thermo Scientific）测量RNA浓度。QuantiTect Reverse Transcription Kit（QIAGEN）对合格的RNA样品进行反转录以合成cDNA，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s和 4 ℃ 30 min。以cDNA 样本为模板，采用7300 实时PCR 仪（ABI，美国），miRNA qRT-PCR 检测试剂盒（GeneCopoeia），测算miR-124-3p、miR-143-3p相对表达，以U6为内参，采用2-ΔΔCt法对miR-124-3p、miR-143-3p水平进行标准化。引物序列：miR-143-3p 正向引物：5'-CTGGCGTTGAGATGAAGCAC-3'，反 向 引 物 ：5'-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3'；miR-124-3p 正 向 引 物 ：5'-TCTTTAAGGCACGCGGTG-3'，反向引物：5'-TATGGTTTGACGACTGTGTGAT-3'；U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 ：5'-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR反应体系：Power SYBR®Green PCR Master Mix 2.5 µL，2 µL cDNA（12.5 ng）特异引物，RNase-Free ddH2O 21 µL。反应条件：95 ℃3 min，95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s，共40个循环。

1.4 认知功能评估 分别于 T0、T1、T2、T3时采用MoCA、MMSE评估患者认知功能。MoCA 从视空间、命名、记忆、注意、语言、抽象思维、延迟记忆、定向评估患者认知功能，若受教育年限≤12 年则加1 分，满分 30 分，＜26 分为异常［6］。MMSE 从定向力、记忆力、注意力和计算力、视空间能力、语言能力进行评估，满分30 分，＜26分为异常［7］。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料符合正态分布以表示，比较采用独立样本t检验；不同时点数据观察采用重复测量的方差分析。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。Pearson 法 分 析 miR-124-3p、miR-143-3p 与 MoCA、MMSE 评分的相关性，采用受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-124-3p、miR-143-3p 诊断老年全身麻醉患者PND的价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-124-3p、miR-143-3p水平比较 两组围术期间血清miR-124-3p、miR-143-3p 水平变化差异有统计学意义（F组间分别为106.352、128.451，P均 ＜0.05），PND 组 血 清 miR-124-3p 水 平 逐 渐 降低，miR-143-3p 水平逐渐增高（F时间分别为68.162、53.097，P均＜0.05），NPND 组血清miR-124-3p、miR-143-3p 水平无明显变化（F时间分别为0.162、1.097，P均＞0.05），组间miR-124-3p、miR-143-3p和时间存在交互效应（F交互分别为42.051、39.652，P均＜0.05）。PND 组 T1-3血清 miR-124-3p 水平低于 NPND 组（P＜0.05），T1-3血清 miR-143-3p 水平高于 NPND 组（P＜0.05），见表1。

表1 两组血清miR-124-3p、miR-143-3p水平比较（）

表1 两组血清miR-124-3p、miR-143-3p水平比较（）

注：与NPND组同时间比较，aP＜0.05。

组别PND组n miR-124-3p miR-143-3p 28 T0T1T2T3 2.98±0.85 2.35±0.61a 1.83±0.42a 1.32±0.30a 1.02±0.26 1.65±0.41a 2.05±0.69a 2.47±0.83a NPND组75 T0T1T2T3 1.05±0.29 1.07±0.30 1.10±0.31 1.11±0.32 2.91±0.90 2.88±0.89 2.85±0.85 2.82±0.86

2.2 两组MoCA、MMSE 评分比较 两组围术期间MoCA、MMSE 评分变化差异有统计学意义（F组间分别为 46.251、35.251，P均＜0.05），PND 组 MoCA、MMSE 评分逐渐降低（F时间分别为 20.531、18.243，P均＜0.05），NPND 组 MoCA、MMSE 评分无统计学变化（F时间分别为 0.531、1.243，P均＞0.05），组间MoCA、MMSE评分和时间存在交互效应（F交互分别为10.425、9.741，P均 ＜0.05）。 PND 组 T1～3MoCA、MMSE评分低于NPND组（P均＜0.05），见表2。

表2 两组不同时点MoCA、MMSE评分比较（分，）

表2 两组不同时点MoCA、MMSE评分比较（分，）

注：与NPND组同时间比较，aP＜0.05。

组别PND组n MoCA MMSE 28 T0T1T2T3 28.45±1.09 25.72±2.26a 23.04±2.03a 22.11±1.75a 28.72±0.81 26.05±3.31a 24.27±2.15a 23.06±1.47a NPND组75 T0T1T2T3 28.43±0.96 27.46±0.67 26.43±0.33 27.39±0.73 28.51±0.86 27.05±0.46 26.54±0.34 27.11±0.98

2.3 PND 患者血清 miR-124-3p、miR-143-3p 水平与 MoCA、MMSE 评分的相关性 PND 组 T1-3时血清 miR-124-3p 水平与 MoCA 评分呈正相关（r分别为 0.296、0.352、0.531，P均＜0.05），与 MMSE评分呈正相关（r分别为 0.302、0.395、0.497，P均＜0.05）；T1-3时 miR-143-3p 水平与 MoCA 评分呈负相关（r分别为-0.235、-0.325、-0.407，P均＜0.05），与 MMSE 评 分 均 呈 负 相 关（r分 别为-0.287、-0.386、-0.417，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-124-3p、miR-143-3p诊断老年全身麻醉患者PND 的价值 T3时miR-124-3p、miR-143-3p诊断老年全身麻醉患者PND 的曲线下面积分别为0.712、0.689，T1、T2时诊断老年全身麻醉患者PND的效能偏低（P均＞0.05）；T3时miR-124-3p、miR-143-3p联合诊断老年全身麻醉患者PND的曲线下面积为0.890，高于 T3时 miR-124-3p、miR-143-3p 单独诊断（Z分别为3.628、3.157，P均＜0.05），见表3。

表3 miR-124-3p、miR-143-3p诊断老年全身麻醉患者PND的效能

3 讨论

PND 指手术前后认知功能的改变，临床表现为学习、记忆、语言、思维、精神、情绪等方面异常，包括术前无认知功能减退、术后谵妄、神经认知恢复延迟和术后认知功能障碍，PND 可明显延长患者住院时间、增加医疗费用和社会负担，甚至增加患者死亡风险［8］。miRNA 是天然存在的长度约 20 个核苷酸的非编码RNA，在细胞水平上调节各种复杂的生物网，由于miRNA 在体液和外周血液中稳定，其异常表达可归因为特定器官病变和病理特征。因此，miRNA 成为各种疾病理想的生物标志物和治疗靶标［9］。有证据表明，miRNA 在 β 淀粉样蛋白斑块形成、神经原纤维缠结、突触损伤和神经元凋亡等过程中发挥调节作用，与认知功能紊乱存在密切关系［10］。

miR-124-3p 是神经元衍生的外泌体中最丰富的 miRNA 之一 ，占 所有 大脑 miRNA 的 25%～48%，miR-124-3p 通过促进神经元特异性剪接调节基因表达，对神经元发育起重要作用，神经损伤可引起miR-124-3p 表达下调，miR-124-3p 表达缺失则引起广泛的神经变性［11］。现有研究显示，miR-124-3p通过靶向抑制其下游靶标-肌球蛋白重链9，激活磷酸肌醇-3 羟激酶/蛋白激酶B 信号通路并抑制核转录因子-κB 信号级联传导，进而抑制小胶质细胞和星形胶质细胞激活，减轻神经炎症反应，促进脊髓损伤后的神经功能恢复［12］。在帕金森病中，miR-124-3p通过靶向抑制膜联蛋白A5［13］或通过调节磷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路［14］，多巴胺能神经元凋亡，增加其活力，发挥神经保护作用。miR-124-3p 与PND 是否存在关联尚不清楚。本研究发现，PND 组术后血清miR-124-3p 水平逐渐降低，且 miR-124-3p 水平与 MoCA、MMSE 评分呈正相关，说明miR-124-3p 缺失可能与老年全身麻醉患者 PND 发生有关。XIAO 等［15］报道显示，心脏手术PND 患者血清miR-124-3p 水平下调，提示miR-124-3p 低水平与术后认知能力下降有关。推测miR-124-3p 参与 PND 的机制：miR-124-3p 通过靶向抑制脂素基因1，减少炎性因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6 的含量以及神经细胞凋亡，阻止β 淀粉样蛋白产生，促使神经细胞增殖和神经发生，在PND中发挥保护作用［16］。因此，miR-124-3p水平下调可能加重神经炎症反应，促使神经细胞凋亡和认知功能损害。

miR-143-3p 是一种高度保守的miRNA，位于人类基因组5 号染色体的33 位，是肿瘤生长的潜在调节因子，可通过不同靶基因调节细胞增殖、迁移、侵袭以及新生血管形成，在子宫内膜样癌、结直肠癌、膀胱癌等实体肿瘤中异常表达［17］。miR-143-3p与神经系统疾病存在密切关系。现有报道显示，miR-143-3p 在脑缺血再灌注损伤小鼠模型中表达上调，miR-143-3p过表达可促使神经细胞凋亡，增加梗死面积和神经损伤程度［18］。体外阿尔茨海默病细胞模型中miR-143-3p 表达增高，沉默miR-143-3p 表达后，β淀粉样蛋白1-42诱导的细胞凋亡得到缓解［19］。本研究发现，老年全身麻醉后发生PND 患者血清miR-143-3p 水平增高，且其水平与认知功能降低有关，说明miR-143-3p 过表达可能加速老年全身麻醉术后认知功能损伤的发展。miR-143-3p参与全身麻醉术后PND的机制尚不清楚，可能机制：LIM结构域激酶1 与环AMP 反应元件结合蛋白相互作用调节突触可塑性和长期记忆，LIM 结构域激酶1 表达缺失与麻醉诱导的认知受损有关［20］。全身麻醉增强miR-143-3p 表达，miR-143-3p 过表达通过靶向抑制其下游靶点LIM 结构域激酶1，降低神经细胞活力，加重神经元细胞损伤和凋亡，引起认知障碍［21］。

ROC 曲线分析结果显示，T3miR-124-3p、miR-143-3p 具有诊断老年全身麻醉患者PND 的效能，其曲线下面积分别为 0.712、0.689，T3时 miR-124-3p、miR-143-3p联合诊断效能明显提高，提示术后7 d血清 miR-124-3p、miR-143-3p 可作为 PND 诊断的辅助指标。

综上所述，老年全身麻醉患者术后血清miR-124-3p 水平降低，miR-143-3p 水平增高，miR-124-3p低水平、miR-143-3p 高水平与术后认知功能降低和PND 发生有关，联合检测术后7 d 血清miR-124-3p、miR-143-3p 可为PND 诊断提供更可靠信息。本研究局限之处在于观察时间较短，miR-124-3p、miR-143-3p与术后远期认知功能障碍是否有关尚待进一步探讨。