橙皮素和秋水仙碱对心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响

鲁晓娜 ,陈云云 ,孟 琰 ,陆 勇 ,唐启红*

1.连云港市第二人民医院药学部,连云港 222000;2.新沂市中医医院妇科,徐州 221400;3.盐城市第一人民医院药剂科,盐城 224000

心肌梗死主要是由冠状动脉持续性缺血、缺氧造成的局部心肌组织细胞的坏死,临床表现为胸骨后疼痛、心律失常等,对患者的身体健康以及生命安全造成严重的威胁[1]。有流行病学调查显示[2],中老年人群是心肌梗死的好发人群。有研究报道[3],在心肌梗死患者的治疗过程中,通过减轻局部心肌梗死损伤程度,促进局部血液供应,对患者的预后具有积极的意义。橙皮素具有显著的扩张血管抑制动脉粥样硬化的作用。秋水仙碱具有显著的抗炎作用,在心脑血管疾病的进展中,对于缺血性心血管疾病的风险具有显著的降低作用[4]。Periostin(POSTN)反映了局部病灶部位纤维化程度,可通过分析免疫球蛋白G4(IgG4)的免疫介导作用,对纤维化炎性反应进行预测[5]。本研究对橙皮素与秋水仙碱配伍对心肌梗死大鼠心肌纤维化及Periostin蛋白、IgG4水平的影响进行分析,为临床治疗提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

离心机[医星医疗(武汉)有限责任公司];生化检测仪(吉安市优特利科技有限公司);PCR 仪器(美国应用生物系统公司)。

1.2 试药

橙皮素(青岛泰东制药有限公司);秋水仙碱(西双版纳药业有限责任公司);Periostin和IgG4 检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 动物

健康雄性大鼠75只,6周龄,体质量为180～200 g,平均(195.33±22.13) g,分笼喂养,控制室温在(22±2) ℃,相对湿度为60%～65%,自然光照,自由饮水、进食。实验动物购自上海斯莱克实验动物有限公司,所有动物实验均获得医院实验动物伦理委员会的批准。

2 方法

2.1 分组与处理

所有大鼠适应性喂养1周后,用随机数字表法将大鼠随机分为5组,假手术组、模型对照组、橙皮素组、秋水仙碱组、橙皮素与秋水仙碱配伍组,每组15只。模型对照组腹腔注射戊巴比妥钠(质量浓度为10 mg·mL-1)进行麻醉,在麻醉状态下将大鼠以仰卧位固定,同时对大鼠机械通气,并同时将大鼠连接动物用心电图仪。在大鼠的左侧第4肋间将其胸腔切开,充分暴露心脏以及大血管,用细丝线,在冠状动脉的左前降支的上方1/3处穿行,在细丝线的两侧用聚四氟乙烯管固定,稳定20 min后,收紧细丝线,用另外一个聚四氟乙烯管固定,阻断大鼠的血流,此时在大鼠的心电图可见ST 段明显抬高,结扎部位以下的心肌组织表现为苍白色或紫绀,则为心肌缺血模型制备成功[6];假手术组参照动物模型制备方法操作,但只穿线不结扎;橙皮素组大鼠腹腔注射橙皮素3 mg·kg-1,每周注射1次,连续注射12周;秋水仙碱组大鼠腹腔注射秋水仙碱1.5 mg·kg-1,每周注射1次,连续注射12周;橙皮素与秋水仙碱配伍组大鼠腹腔注射橙皮素和秋水仙碱,连续注射12周。

2.2 检测方法

2.2.1 大鼠的心脏超声检测 5组实验大鼠用DWT6型彩色多普勒超声仪RMV716高频探头进行定位,同时对5 组实验大鼠的左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短轴率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)和左室收缩末期内径(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)进行比较。

2.2.2 大鼠的心肌纤维检测 处死大鼠后,采集心肌组织,用二甲苯浸泡后,用不同酒精梯度进行脱水处理,用苏木精染色。在显微镜下分别对5组大鼠心肌细胞的排列以及炎性细胞的聚集情况进行比较。

2.2.3 Periostin、IgG4水平检测 分别对5组大鼠进行尾静脉采血,用酶联免疫法检测并分析大鼠的Periostin、IgG4水平差异。

2.2.4 炎性指标检测 分别采集所有实验大鼠的血液4 mL,以3 500 r·min-1离心15 min,用全自动生化仪对实验大鼠的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β)以及白细胞介素-6(interleukin-6)水平进行比较。

2.2.5 流式细胞仪免疫指标检测 用流式细胞仪对实验大鼠的血浆进行检测,对3组实验大鼠的CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞进行比较。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 心脏超声结果比较

5组实验大鼠的LVEF(F=12.036,P=0.000)、LVFS(F=11.286,P=0.000)、LVIDd(F=25.663,P=0.000)、LVIDs(F=29.654,P=0.000)之间的差异有统计学意义,通过两两比较,5组实验大鼠的LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs从高到低依次为假手术组、橙皮素与秋水仙碱配伍组、秋水仙碱组、橙皮素组、模型对照组,LVIDd、LVIDs从高到低依次为模型对照组、橙皮素组、秋水仙碱组、橙皮素与秋水仙碱配伍组、假手术组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表1。

表1 5组大鼠心脏超声结果的比较 (n=15,)Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound results of rats in the 5 groups (n=15,)

表1 5组大鼠心脏超声结果的比较 (n=15,)Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound results of rats in the 5 groups (n=15,)

注:与假手术组比较,aP＜0.05;与模型对照组比较,bP＜0.05;与橙皮素组比较,cP＜0.05;与秋水仙碱组比较,dP＜0.05。

3.2 心肌纤维的炎性、结构比较

假手术组大鼠心肌纤维排列较整齐,结构完整,细胞大小较正常,有较完整的细胞核;模型对照组心肌细胞的排列较紊乱,细胞的形态、大小存在显著的差异,细胞质的染色呈现不均匀性,细胞内可见大量的炎性物质;而橙皮素与秋水仙碱配伍组大鼠心肌细胞的排列较橙皮素组和秋水仙碱组整齐,细胞的大小的差异较橙皮素组、秋水仙碱组小。

3.3 Periostin、IgG4水平的比较

5组实验大鼠的Periostin 蛋白(F=20.266,P=0.000)、IgG4(F=29.658,P=0.000)水平之间的差异具有统计学意义,通过两两比较,5组大鼠的Periostin、IgG4水平从高到低依次为模型对照组、橙皮素组、秋水仙碱组、橙皮素与秋水仙碱配伍组、假手术组。结果见表2。

表2 5组实验大鼠Periostin、IgG4水平的比较 (n=15,)Tab.2 Comparison of Periostin and IgG4 levels of experimental rats in the 5 groups (n=15,)

表2 5组实验大鼠Periostin、IgG4水平的比较 (n=15,)Tab.2 Comparison of Periostin and IgG4 levels of experimental rats in the 5 groups (n=15,)

注:与假手术组比较,aP＜0.05;与模型对照组比较,bP＜0.05;与橙皮素组比较,cP＜0.05;与秋水仙碱组比较,dP＜0.05。

3.4 炎性指标分析

5组实验大鼠的TNF-α(F=22.587,P=0.000)、IL-1β(F=26.354,P=0.000)、IL-6(F=33.544,P=0.000)之间的差异有统计学意义,通过两两比较,5组实验对大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6从高到低依次为模型对照组、橙皮素组、秋水仙碱组、橙皮素与秋水仙碱配伍组、假手术组。结果见表3。

表3 5组实验大鼠炎性指标的比较 (n=15,)Tab.3 Comparison of inflammatory indexes of rats in the 5 groups (n=15,)

表3 5组实验大鼠炎性指标的比较 (n=15,)Tab.3 Comparison of inflammatory indexes of rats in the 5 groups (n=15,)

注:与假手术组比较,aP＜0.05;与模型对照组比较,bP＜0.05;与橙皮素组比较,cP＜0.05;与秋水仙碱组比较,dP＜0.05。

3.5 免疫指标比较

5组实验大鼠CD3+T、CD3+T 之间的差异无统计学意义,5组实验大鼠的CD4+T 之间的差异有统计学意义,橙皮素与秋水仙碱配伍组大鼠的CD4+T显著高于其他各组。结果表4。

表4 5组实验大鼠的免疫指标的比较 (n=15,)Tab.4 Comparison of immune indexes of rats in the 5 groups(n=15,)

表4 5组实验大鼠的免疫指标的比较 (n=15,)Tab.4 Comparison of immune indexes of rats in the 5 groups(n=15,)

4 讨论

研究显示[7],心肌梗死的进展与心肌细胞的凋亡呈现显著的相关性,以往的动物实验已经证实[8-9],通过对大鼠心肌细胞进行药物干预,对心肌细胞的凋亡具有明显的抑制作用。

本研究中,通过对5组实验大鼠心脏超声指标进行分析,秋水仙碱与橙皮素联合用药组大鼠的心脏超声的恢复情况显著优于单独用药组。活化成纤维细胞在心肌梗死的进展中发挥重要的促进作用,因此抑制患者成纤维细胞的激活、迁移以及增殖过程,从而延缓心肌梗死的进展,成为治疗心肌梗死可行的靶向机制[10]。秋水仙碱通过抑制患者的RhoA/ROCK信号转导通路,抑制成纤维细胞的活化,显著减轻心肌细胞的损伤。橙皮素主要来自于芸香科的柑橘,具有健胃、祛痰、利尿等作用[11]。在心肌梗死患者的疾病进展中,因机体TGF-β通路被显著抑制,从而导致患者的smad2和smad3发生磷酸化,与smad4形成复合体,加剧局部病灶部位的炎性反应以及活性氧自由基的进一步释放,加剧了心肌细胞的损伤[12]。本研究对实验大鼠心肌细胞的纤维化情况进行分析,用橙皮素和秋水仙碱进行联合干预后,损伤心肌细胞发生修复的可能性显著提升,心肌细胞的排列顺序趋于整齐,细胞核的完整性趋于恢复,对心肌细胞摄取氧气、血液均具有重要的意义[13]。另外,本研究中通过对血清学指标进行分析,橙皮素与秋水仙碱配伍组实验大鼠的血清学Periostin、IgG4水平以及炎性指标均显著低于单独用药组。Periostin最早是在恶性肿瘤患者中发现其特有的生理功能,而近年来的研究已经发现[14-16],Periostin 与基质蛋白(如胶原1 型蛋白、胶原5型蛋白以及黏连蛋白)结合后,能够促进病理性纤维化的形成。在本研究中,随着对实验大鼠的干预,实验大鼠Periostin的表达水平呈现显著下降的趋势,提示心肌的重构作用显著减弱。秋水仙碱和橙皮素的联合使用可发挥对心肌成纤维细胞增殖以及炎性反应的双重抑制作用,在对心肌梗死大鼠的治疗中呈现协同作用,对心肌梗死的治疗具有重要的作用[17-18]。杨敏等[19]在对急性冠脉综合征患者的分析中,冠心病的严重程度与Periostin的表达水平呈负相关,与本研究的结果一致。IgG4主要反映局部病灶部位的免疫水平,随着局部病灶部位纤维化程度的显著升高,局部病灶部位的免疫水平也相对升高,局部病灶部位的免疫水平可以在一定程度上反映局部病灶部位的纤维化程度。因此,IgG4对于机体心肌细胞的免疫系统以及局部病灶部位的纤维化程度具有一定程度的表征意义[20]。用秋水仙碱和橙皮素联合用药后,心肌梗死大鼠成纤维细胞的活化程度显著降低,局部组织由于纤维化造成的炎性反应水平显著下降,对疾病的预后具有积极的意义。

综上所述,心肌梗死大鼠采用橙皮素与秋水仙碱配伍治疗,心肌纤维化显著改善,Periostin 蛋白、IgG4的水平显著降低,效果较好。