HPLC-MS/MS法研究阿立哌唑不同晶型的药动学差异

郭欢迎,杨亚婷,王荪璇,王嫦鹤

陕西省食品药品检验研究院,西安 710065

药物多晶型是指某一固体状态药物至少存在2种或2种以上的分子排列方式,这些不同的排列方式形成了多种不同状态的晶型[1]。药物常见的多晶型包括晶型态、无定型态、溶剂化物和水合物等。同一种药物的不同晶型往往具有不同的理化性质,如熔点、化学反应性、溶解度、密度、蒸气压和固体剂型的可制造性等[2-3]。对于水溶性差的药物,其溶出往往成为体内吸收过程的限速过程,从而影响疗效和安全性[4]。阿立哌唑难溶于水,其晶型和粒度成为影响药物吸收的主要因素,因此,针对阿立哌唑晶型的研究成为研究的热点。

阿立哌唑(aripiprazole)化学名为7-[4-[4-(2,3-二氯苯基)-1-哌嗪基]丁氧基]-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮,为二氢喹啉酮类抗精神病药[5]。可部分激动多巴胺受体(D2)及5-羟色胺受体(5-HT1A),使多巴胺信号稳定在正常限度,同时拮抗5-HT2A受体,从而具有治疗精神分裂症的作用[5-6],阿立哌唑对精神分裂症的阳性和阴性症状均有治疗作用[7]。阿立哌唑具有独特的治疗精神病的作用机制,相对于经典的抗精神病药物,如氯丙嗪、奋乃静、氟哌啶醇、氯氮平等,其不但有效避免了锥体外系反应的发生,而且降低了嗜睡及体质量增加等一系列不良反应的发生率[8]。

在体内,阿立哌唑主要经3 种生物转化途径代谢,即脱氢化、羟基化和N-脱烷基化。细胞色素P450代谢酶CYP3A4 和CYP2D6 主要参与脱氧和羟基化,其中CYP3A4还参与N-催化脱烷基化。阿立哌唑的脱氢代谢产物脱氢阿立哌唑与D2受体具有相似的亲和力,与阿立哌唑在临床药理效果上并无明显差异。因此,阿立哌唑和脱氢阿立哌唑共同构成本品抗精神病的有效成分[9]。

阿立哌唑是一种典型的多态性药物,迄今已知存在17种多晶型[10-16]。本研究的前期工作已经制备了阿立哌唑的4种晶型,并采用粉末X 线衍射法、差示扫描量热法、红外光谱法对4种晶型进行了表征,通过与相关参考文献中的数据进行比对[10-16],确定4种晶型分别为晶型α、晶型Ⅳ、倍半水合物和新晶型[17]。本研究通过对不同晶型药代动力学的差异进行研究,为阿立哌唑原料及剂型的开发提供数据支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LCMS-8040型液相色谱-质谱联用仪(包括LC-30AD 泵、CTO-30A 柱温箱、SIL-30AC自动进样器、SPD-20A 紫外检测器、8040 三重四级杆质谱仪、ATN-1050氮气发生器、Lab Solution 色谱工作站,日本岛津公司);ME235S型分析天平(德国赛多利斯公司);Vortex 4 型旋涡混匀器(德国IKA 公司);SCQ-200型超声波清洗器(上海声浦超声设备厂);氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);HH-2型数显恒温水浴锅(江苏常州国华电器有限公司)。

1.2 试药

阿立哌唑的4种晶型,晶型α(Formα)、晶型Ⅳ(Form Ⅳ)、倍半水合物(sesquihydrate)和新晶型(new form)均为自制;阿立哌唑对照品(批号100776-201302,质量分数为99.9%),替米沙坦对照品(批号100629-201202)均购自中国食品药品检定研究院;脱氢阿立哌唑对照品(批号38-GHZ-113-1,质量分数为99.9%,加拿大Toronto Research Chemicals公司);甲酸铵(色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇和乙腈均为色谱纯,均购自美国Honeywell Burdick &Jackson公司;高纯水(美国Millipore公司);其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

SD 雄性大鼠,体质量为(280±20) g,购自西安交通大学医学实验动物中心,许可证号为SCKX(陕)0073276。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Thermo-C18(100 mm×4.6 mm,1.7 μm);流动相:甲醇-50 mmol·L-1甲酸铵溶液(10∶90);流速:0.2 mL·min-1;柱温:40 ℃;进样量:5 μL。

2.1.2 质谱条件 用电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI),正离子电离;毛细管电压为1.82 kV;脱溶剂气温度为250 ℃,加热模块温度为400 ℃,CID气压为230 kPa,喷雾器氮气(N2)的流速为3.0 L·min-1,干燥气体氮气的流速为15.0 L·min-1;用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)的质谱扫描方式测定(m/z):阿立哌唑448.0→285.1,脱氢阿立哌唑446.1→285.1,替米沙坦515.1→497.3。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液的配制 精密称取阿立哌唑、脱氢阿立哌唑对照品各10 mg,分别置于100 mL量瓶中,用甲醇定容并稀释至刻度。分别精密量取上述2种溶液适量,用甲醇定量稀释,制成阿立哌唑和脱氢阿立哌唑质量浓度分别为1、0.1 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 内标溶液的配制 精密称取替米沙坦对照品10 mg,置于50 mL 量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度。精密量取上述溶液1 mL,置于100 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,得到质量浓度为2 μg·mL-1的内标溶液。

2.3 样品的预处理

取血浆样品100 μL,置于1.5 mL离心管中,加入内标溶液(质量浓度为2 μg·mL-1)10 μL,涡旋振荡1 min,加入醋酸乙酯500 μL,涡旋振荡3 min,在4 ℃以12 000 r·min-1离心10 min,取上清液,在37 ℃下用氮气吹干,加入100 μL 甲醇复溶,取5 μL 进 样分析。

2.4 专属性

取大鼠空白血浆100 μL,分别加入混合对照品溶液和内标溶液各10 μL,按照2.3项下血浆样品处理方法处理后,按照2.1项下色谱、质谱条件进样分析。结果见图1。结果显示,主成分与内标物的分离良好,内源性物质无干扰,该方法的专属性良好。

图1 MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms

2.5 线性范围和定量限

取空白血浆,分别加入混合对照品溶液适量,制成系列质量浓度对照溶液,其中阿立哌唑的质量浓度分别为5、10、20、50、100、200 ng·mL-1,脱氢阿立哌唑的质量浓度分别为0.5、1、2、5、10、20 ng·mL-1。按照2.3项下血浆样品处理方法处理后,按照2.1项下色谱、质谱条件进样分析。分别以测得的阿立哌唑、脱氢阿立哌唑峰面积(Ai)与内标峰面积(As)的比值Ai/As为纵坐标(y),以阿立哌唑、脱氢阿立哌唑质量浓度(C)为横坐标(x)绘制标准曲线,经最小二乘法线性回归。阿立哌唑的回归方程为y1=0.024x1+0.007,r=0.999 5,线性质量浓度范围为5～200 ng·mL-1,最低定量限质量浓度为1 ng·mL-1;脱氢阿立哌唑的回归方程为y2=0.021x2+0.003,r=0.999 2,线性质量浓度范围为0.5～20 ng·mL-1,最低定量限质量浓度为0.2 ng·mL-1。

2.6 精密度和回收率实验

取空白血浆100 μL,加入适量混合对照品溶液,制成低、中、高质量浓度(每一质量浓度平行操作3次)溶液,按照2.3项下血浆样品处理方法处理后,按照2.1项下色谱、质谱条件进样分析。分别在1 d内重复测定6 次,在3 d内每日重复测定6次,计算日内、日间精密度,测得量与加入量的比值为回收率。结果见表1。

表1 精密度、基质效应及提取回收率实验结果Tab.1 Results of precision,matrix effect and extraction recovery

2.7 基质效应

取空白血浆100 μL,置于1.5 mL 离心管中,涡旋振荡1 min,加入醋酸乙酯500 μL,涡旋振荡3 min,在4 ℃以12 000 r·min-1高速离心10 min,取上清液,加入混合对照品溶液及内标溶液适量,涡旋混匀1 min,制成低、中、高质量浓度(每一质量浓度平行操作3次)含基质样品。在37 ℃下用氮气吹干,加入100 μL甲醇复溶,取5 μL,按照2.1项下色谱、质谱条件进样分析,记录色谱图,阿立哌唑、脱氢阿立哌唑和内标的峰面积分别记作A1、A2和A3。另分别取混合对照品溶液适量,加入内标溶液10 μL,用甲醇稀释制成低、中、高质量浓度(每一质量浓度平行操作3次)的对照品溶液,取5 μL 按照2.1项下色谱、质谱条件进样分析,记录色谱图,阿立哌唑、脱氢阿立哌唑和内标物的峰面积分别记作B1、B2和B3。按照(Ai/Bi)×100%分别计算阿立哌唑、脱氢阿立哌唑和内标物的基质效应。结果见表1。

2.8 药动学研究

雄性SD 大鼠40只,体质量为(280±20) g,随机分为5组,每组8只,给药前禁食12 h,自由饮水。取阿立哌唑4种晶型样品,置于研钵中研细,过100目筛。精密称取过筛样品适量,用生理盐水混悬后,迅速灌胃给予阿立哌唑2 mg·kg-1,分别于给药后15、30 min及1、2、3、4、6、8、12、24、48 h取颈静脉血0.3～0.4 mL,置于肝素润洗过的离心管中,以3 000 r·min-1离心10 min,取上清液100 μL,置于1.5 mL 离心管中,按照2.3项下血浆样品处理方法处理后,按照2.1项下色谱、质谱条件进样分析。计算不同时间点各晶型阿立哌唑及其活性代谢物脱氢阿立哌唑的血药质量浓度,绘制血药质量浓度-时间曲线,见图2。

图2 大鼠单剂量灌胃阿立哌唑不同晶型2 mg·kg-1后的平均血药质量浓度-时间曲线 (n=8)Fig.2 Plasma concentration-time curves in rats following a single dose intragastric administration of 2 mg·kg-1 of aripiprazole different crystal forms (n=8)

用DAS 2.0软件,用二室模型对测得的血药质量浓度进行药代动力学参数的计算。用SPSS 10.0软件进行数据处理,结果以表示,组间比较用ANOVA 分析。阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的药代动力学参数见表2、表3。

表2 阿立哌唑的药代动力学参数 (,n=8)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of aripiprazole (,n=8)

表2 阿立哌唑的药代动力学参数 (,n=8)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of aripiprazole (,n=8)

注:与晶型α 比较,*P＜0.05。

表3 脱氢阿立哌唑的药代动力学参数 (,n=8)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of dehygroaripipracole (,n=8)

表3 脱氢阿立哌唑的药代动力学参数 (,n=8)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of dehygroaripipracole (,n=8)

注:与晶型α 比较,*P＜0.05。

由图2A 和表2可知,大鼠分别单剂量灌胃给予阿立哌唑的4种晶型2 mg·kg-1后,新晶型组和晶型α组的阿立哌唑Cmax和AUC(0～48)显著高于晶型Ⅳ组和倍半水合物组。表明新晶型和晶型α在体内具有良好的吸收和生物利用度,这2种晶型在大鼠体内的Cmax分别为(118.60±15.88)、(122.03±17.27)ng·L-1,差异无统计学意义;AUC(0～48)相近,分别为(1 399.01±65.17)、(1 506.95±72.36) ng·L-1·h;新晶型组的tmax为(2.13±0.61) h,明显短于晶型α组的(3.85±0.98) h(P＜0.05)。新晶型组和晶型α组的Cmax和AUC(0～48)均大于其他2种晶型,新晶型的吸收速度快于晶型α。

由图2B和表3可知,大鼠分别单剂量灌胃给予阿立哌唑的4种晶型2 mg·kg-1后,新晶型组和晶型α组的脱氢阿立哌唑Cmax和AUC(0～48)显著高于晶型Ⅳ和倍半水合物组。新晶型和晶型α的脱氢阿立哌唑Cmax分别为(11.67±1.88)、(12.08±1.33) ng·L-1,AUC(0～48)分别为(357.80±6.56)、(376.68±7.64)ng·L-1·h,均大于其他2种晶型;新晶型组的tmax为(7.69±0.12) h,短于晶型α组的(7.94±0.14) h(P＜0.05),表明新晶型在大鼠体内的吸收速度快于晶型α,其代谢物脱氢阿立哌唑的速度也快于晶型α。

以上结果表明,不同晶型在大鼠体内的吸收情况存在一定的差异。新晶型和晶型α的体内生物利用度相近,均优于其他晶型,且新晶型比晶型α吸收更快、起效更快。

3 讨论

根据各国专利报道[10-17],阿立哌唑存在多晶型现象,不同晶型的粉末X 线衍射图谱、差示扫描量热曲线以及红外光谱存在一定差异。目前,我国医药工业所采用的以及《中华人民共和国药典》(2020年版二部)阿立哌唑原料项下所控制的晶型均为乙醇重结晶产物,即晶型α[18]。

阿立哌唑属于生物药剂学分类系统(BCS)Ⅱ类低溶解高渗透性药物,提高药物的溶解度和溶出速度可加快药物的吸收。临床上阿立哌唑的常用剂型为口腔崩解片,以促进吸收、增加生物利用度。药代动力学研究结果表明,大鼠口服阿立哌唑晶型α后的tmax约为3.85 h,与文献[19-20]中的结果基本一致。不同晶型在大鼠体内的吸收情况存在一定的差异。新晶型和晶型α的体内生物利用度相近,均优于其他晶型,但新晶型比晶型α吸收更快、起效更快,可作为工业生产中晶型α的替代晶型。