HPLC法测定消糖胶囊中盐酸小檗碱、葛根素和虎杖苷的含量

王旭芳 ,魏敬东 ,刘 伦 ,张欣蕾 ,林嗣松 ,李 捷 ,王四旺*

1.西北大学生命科学与医学部,西安 710069;2.空军军医大学中药与天然药物学教研室,西安 710032;3.西安颂天乐济生物科技有限公司,西安 710032

糖尿病在中医学中称为消渴病,临床上以高血糖为主要特点,其主要表现为“三多一少”症状,即多尿、多食、多饮、消瘦。中医认为,消渴病主要是由于燥热偏盛、阴津亏耗所致。中医关于消渴病的治则是滋阴清热、益气养阴[1]。

消糖胶囊是由本实验室结合糖尿病中医临床治疗制成的中成药,由玄参、知母、黄芩、葛根、地骨皮、虎杖等多味中药组成,其主要功效是滋阴补气、清肺养胃、降糖降脂,主治2型糖尿病。处方中的君药主要活性成分为盐酸小檗碱,能够刺激AMP活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK),减轻体质量,改善葡萄糖耐量[2-3]。虎杖及其活性成分虎杖苷具有改善微循环、抗氧化、降血脂等药理作用,对糖尿病血管损伤具有一定的缓解作用[4-5]。葛根具有生津止渴、升阳止泻的功效,用于口渴、消渴等证的治疗,其主要活性物质为葛根素[6-7]。

为更好地控制消糖胶囊的质量,开展后续药学和临床研究,保证临床的安全使用,本实验对消糖胶囊中的主要成分盐酸小檗碱[8-10]、虎杖苷[11-12]和葛根素[13-15]进行含量测定,为消糖胶囊质量标准的制定提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010A HT 型高效液相色谱仪(日本岛津公司);四元梯度泵(美国Bio-Rad公司);在线真空脱气机(美国Eppendorf公司);Sartorius ME235S型电子分析天平(德国Sartorius公司);超纯水系统(美国Millipore公司);SK250-LHC型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);电子恒温水浴锅(北京化玻医疗器械有限公司)。

1.2 试药

甲醇和乙腈[色谱级,赛默飞世尔科技(中国)有限公司];磷酸(天津富宇精细化工有限公司)。

对照品:虎杖苷(质量分数≥98%,批号19062702,成都曼斯特生物科技有限公司);盐酸小檗碱(质量分数≥98%,批号110713-200609)和葛根素(质量分数≥98%,批号752-200108),均购自中国食品药品检定研究院;消糖胶囊由本实验室自制。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

消糖胶囊内容物为棕褐色粉末或颗粒,气微香,味酸、微苦。

2.2 制剂中葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱含量的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil 100-5 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相:乙腈(A)-1mL·L-1磷酸溶液(B)。梯度洗脱:0～20 min,17%～22% A;20～32 min,22%～26% A。流速:1.0 mL·min-1。柱温:30 ℃。检测波长:306 nm。进样量:10 μL。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取消糖胶囊内容物粉末30 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,精密称定质量,超声处理30 min,放冷,称定质量,用甲醇补足减失的质量,过滤,取续滤液,即得。

2.2.3 混合对照品溶液的制备 分别精密称取减压干燥12 h的葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱对照品适量,加体积分数50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成质量浓度分别为0.12、2.50、6.01 mg·mL-1的葛根素、虎杖苷、盐酸小檗碱对照品溶液。精密吸取各对照品溶液1 mL,置于5 mL量瓶中,加体积分数50%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。

2.2.4 系统适用性实验 取上述混合对照品溶液和供试品溶液,按照2.2.1项下的色谱条件进样检测,结果见图1。葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的出峰时间分别为8.198、20.092、31.716 min,表明供试品中其他组分不干扰葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的测定,并且待测成分与其他峰的分离度良好,溶剂对待检测物质无干扰[16]。

2.2.5 专属性实验 精密称取处方中除葛根外的其他药材,按制剂工艺制备缺葛根的阴性制剂,取该制剂30 mg,按照2.2.2项下供试品溶液制备方法制备缺葛根的阴性供试品溶液。同法分别制备缺虎杖和缺盐酸小檗碱的阴性制剂,再按照供试品溶液制备方法制备缺虎杖和缺盐酸小檗碱的阴性供试品溶液。分别精密吸取各阴性供试品溶液10 μL 注入液相色谱仪,进行测定,结果见图1。结果显示,阴性样品的色谱图中在与对照品相同保留时间位置上无吸收峰,表明该方法的专属性好、灵敏度高[17]。

图1 消糖胶囊HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of Xiaotang Capsules

2.2.6 线性关系考察 精密吸取2.2.3项下的混合对照品溶液1 mL,置于10 mL 量瓶中,再以此法逐级稀释成6个系列质量浓度的混合对照品溶液,分别按照2.2.1项下的色谱条件进样测定,以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y),进行回归,结果见表1,表明线性关系良好。

表1 葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的线性关系Tab.1 Linear relationship of puerarin,polydatin and berberine hydrochloride

2.2.7 精密度实验 取2.2.3项下的混合对照品溶液,连续进样6次,分别检测葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的峰面积,计算RSD 值。计算得葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的RSD 值分别为0.53%、1.74%、1.35%,表明仪器的精密度良好。

2.2.8 稳定性实验 精密吸取2.2.2项下制备的供试品溶液10 μL,分别于0、2、4、6、8 h注入液相色谱仪检测,记录峰面积,计算RSD 值。葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的RSD 值分别为1.26%、1.31%、1.41%(n=6),表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性实验 精密称定消糖胶囊内容物粉末6份,按照2.2.2 项下方法制备供试品溶液,按照2.2.1项下色谱条件进样检测。计算3种成分的平均含量和RSD 值。计算得葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的RSD值分别为0.80%、1.00%、1.71%(n=6),表明该样品制备方法稳定可靠、重复性好。

2.2.10 加样回收率实验 精密称定消糖胶囊内容物粉末6份,每份15 mg,按各成分在样品中的含量与相应对照品为1∶1的比例,精密加入各对照品,按照2.2.2项下供试品制备方法,制成供试品溶液,进样分析,计算各成分的平均回收率及RSD 值。结果见表2。计算得葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的平均回收率分别为97.76%、99.89%、105.33%,RSD 值分别为0.93%、2.01%、2.06%(n=6),表明该方法的回收率良好。

表2 加样回收率实验结果Tab.2 Results of recovery test

2.2.11 样品含量测定 精密称定3个批次的消糖胶囊样品,每个样品取3份,按照2.2.2项下供试品制备方法制备样品,按照2.2.1项下的色谱条件进样检测,记录3种成分的峰面积,计算消糖胶囊供试品中葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱的含量。结果见表3。计算得样品中葛根素、虎杖苷、盐酸小檗碱的平均含量分别为0.127 7、0.151 6、42.434 5 mg·粒-1(每粒按0.4 g计算)。

表3 消糖胶囊中葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱含量测定结果Tab.3 Results of content determination of puerarin,polydatin and berberine hydrochloride in Xiaotang Capsules

3 讨论

3.1 提取方法的选择

实验过程中用不同溶剂(水、甲醇、乙醇)和不同提取方法(超声、加热回流)对样品进行处理,结果显示,以甲醇为提取溶剂超声提取时,各色谱峰分离度较好,故选择甲醇超声作为供试品溶液的提取方法。

3.2 检测波长的选择

本实验用DAD 检测器对盐酸小檗碱、葛根素和虎杖苷在190～800 nm 处进行全波长扫描[18-20],结果显示,盐酸小檗碱λmax=237、266、349 nm,葛根素λmax=242、306nm,虎杖苷λmax=218、309 nm,通过考察不同检测波长下的色谱峰丰度和分离度,发现3种成分在306nm 处基线平稳,色谱丰度好,且无杂质干扰,故选择以306 nm 作为检测波长。

3.3 流动相的选择

实验过程中用不同的流动相(乙腈-1mL·L-1磷酸水溶液、乙腈-0.5mL·L-1磷酸水溶液、乙腈-1mL·L-1醋酸水溶液)进行梯度洗脱。结果显示,以乙腈-1mL·L-1磷酸水溶液梯度洗脱时,分离效果更好,且峰形较好,故选择其作为流动相。

本实验成功建立了测定消糖胶囊制剂中葛根素、虎杖苷和盐酸小檗碱3种成分的HPLC 法。该方法专属性强、重复性好、可行性强,能够用于消糖胶囊的质量控制。