波长切换-超高效液相色谱法检测女珍颗粒中特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量

张 钊 ,闫武超 ,武星旭 ,王彩龙 ,赵 阳

1.张家口市第四医院药剂科,张家口 075000;2.张家口市第四医院功能科,张家口 075000

女珍颗粒是由女贞子、墨旱莲、地黄、紫草等10味药材经研细、煎煮、浓缩、制粒等工艺制成的中药颗粒剂。更年期综合征又称围绝经期综合征,是指妇女绝经前、后所表现出来的一系列临床综合症状[1]。女珍颗粒具有滋肾、宁心的药效,临床主要用于更年期综合征属肝肾阴虚、心肝火旺证者的治疗,能够改善患者烘热汗出、五心烦热、心悸、失眠等症状[2]。10味药材中,女贞子有滋补肝肾、明目乌发等功效[3-5];墨旱莲有滋补肝肾、凉血止血等功效[6-8];紫草有清热凉血、活血解毒、透疹消斑等功效[9-11]。随着我国老龄化进程的加快,女珍颗粒在临床应用越发广泛,因此加强对女珍颗粒的质量控制,可有效保障老龄妇女的用药安全。女珍颗粒现收载于2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)一部[12],其中含量测定项仅针对女贞子药材,即仅测定特女贞苷的含量,项目单一,不能全面地反映该产品的质量。本实验研究女珍颗粒的药材组成,针对女贞子、旱墨莲和紫草3种主要药材[13-20],建立测定女珍颗粒中特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的波长切换-超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型主机,2998型DAD检测器,包括在线脱气机、自动进样器、EMPOWER色谱工作站(美国沃特世科技有限公司);KQ-300GVDA 型超声仪(昆山舒美超声仪器有限公司);Agilent Eclipe SB C18液相色谱柱(美国Agilent 科技有限公司);Mettler-Toled AE200型电子天平(万分之一,梅特勒-托利多公司);Milli-q Academic型超纯水仪(美国密理博公司)。

1.2 试药

特女贞苷(批号111926-201906,质量分数为95.0%);蟛蜞菊内酯(批号111885-202105,质量分数为97.2%);β,β′-二甲基 丙烯酰 阿卡宁(批 号111689-201805,质量分数为98.0%),均购自中国食品药品检定研究院;女珍颗粒(规格:6 ·袋-1,批号:20210225、20210613、20210842,山东凤凰制药股份有限公司);乙腈、甲醇(色谱纯,美国FLUKA 公司);冰醋酸(优级纯,中国医药集团有限公司);超纯水(自制);其他试剂均为分析纯,均购自中国医药集团有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipe SB C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm);柱温:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:225 nm(特女贞苷)、352 nm(蟛蜞菊内酯)、276 nm(β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁);进样量:10 μL;流动相:5 mL·L-1冰醋酸溶液(A),-乙腈(B);梯度洗脱,洗脱程序:0～5 min,4% B,5～11 min,4%～47% B,11～23 min,47%～91% B,23～28 min,91% B,28～28.5 min,91%～4% B,28.5～33 min,4% B。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液 取特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品,加甲醇分别制成每1 mL溶液中含特女贞苷475 μg、蟛蜞菊内酯97.2 μg、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁196 μg的对照品储备液,摇匀。

2.2.2 对照品溶液 取2.2.1项下特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品储备液,分别精密吸取1.0 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,得特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁质量浓度分别为47.5、9.72、19.6 μg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 取女珍颗粒供试品,研细,精密称取0.5 g,置于50 mL量瓶中,加甲醇约35 mL,超声处理20 min后取出(超声功率为200 W,超声频率为70 kHz),放冷至室温,加甲醇定容,混匀,用0.22 μm 滤膜过滤,取续滤液,作为供试品溶液。

2.2.4 阴性供试品溶液 按女珍颗粒药材比例和制备方法,分别制备不含女贞子、墨旱莲和紫草的阴性供试品,阴性供试品按供试品溶液制备方法进行配制。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 分别取2.2项下制备的对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液,按2.1项下色谱条件,分别进样10 μL,收集色谱图。结果显示,阴性供试品溶液在特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁对应的位置无干扰峰出现,且3种指标成分理论塔板数、分离度等符合2020 年版《中国药典》中的要求。结果见图1。

图1 典型HPLC图Fig.1 Typical HPLC chromatogram

2.3.2 线性关系考察 取2.2.1项下特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品储备溶液,分别精密量取适量,加甲醇制备含特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁系列曲线溶液,按2.1项下色谱条件,分别进样10 μL,收集色谱图。以各对照品质量浓度为横坐标(x)、对应峰面积为纵坐标(y)进行线性回归。结果见表1。

表1 曲线方程、相关系数及范围Tab.1 Linear curve equations,correlation coefficients and concentration ranges

2.3.3 加标回收实验 取已知特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的女珍颗粒(规格:6 g·袋-1,批号20210225),研细,精密称取约0.5 g,置于50 mL量瓶中,共称取6份平行样品。分别加入2.2.1 项下对照品储备溶液适量,后续按2.2.3项下方法进行处理,得6份加标测试溶液,按2.1项下色谱条件,分别进样10 μL,收集色谱图,计算加标回收率。结果见表2。

表2 加标回收实验结果Tab.2 Results of standard addition recovery test

2.3.4 精密度实验 取2.2.2项下对照品溶液,按2.1项下色谱条件,进样10 μL,连续进样6次,收集色谱图。根据特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁峰面积计算相对标准偏差(RSD)。计算得特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁精密度的RSD 值分别为0.71%、0.52%、1.01%,表明仪器的精密度良好。

2.3.5 重复性实验 取女珍颗粒(规格:6 g·袋-1,批号20210225),研细,精密称取0.5 g,共称取6份平行样品,后续按2.2.3项下方法进行处理,得6份重复性检查溶液,按2.1 项下色谱条件,分别进样10 μL,收集色谱图。根据特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁检测结果计算RSD 值。计算得特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁重复性的RSD 分别为1.2%、0.91%、1.3%,表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性实验 取女珍颗粒(规格:6 g·袋-1,批号20210225),按2.2.3项下方法进行处理,制备供试品溶液;于室温下放置0、3、6、9、15、24 h后,按2.1项下色谱条件,每个时间点进样10 μL,收集色谱图。根据特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁峰面积计算RSD 值。计算得特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁峰面积的RSD 值分别为1.2%、1.3%、1.5%,表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 市售供试品的检测

取女珍颗粒(规格:6 g·袋-1,批号:20210225、20210613、20210842,生产厂家山东凤凰制药股份有限公司),按2.2.3项下方法进行处理,制备供试品溶液,每个样品制备2份平行样品;再按2.1项下色谱条件,分别进样10 μL,收集色谱图。计算3批样品中特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量。结果见表3。

表3 供试品含量检测结果Tab.3 Results of content determination of samples

3 讨论

3.1 流动相体系的选择

液相色谱法常用的流动相有甲醇体系和乙腈体系,实验分别考察将甲醇-水、乙腈-水、5 mL·L-1醋酸溶液-甲醇和5 mL·L-1醋酸溶液-乙腈作为流动相体系时,特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁3种目标物的出峰时间、分离效果等。结果显示,选择甲醇-水体系时,3种目标物的出峰时间较长,检测效率偏低;选择乙腈-水体系时,蟛蜞菊内酯色谱峰发生分叉,定量结果不准确;选择5 mL·L-1醋酸溶液-乙腈体系时,3种指标成分分离良好,出峰时间较短,且无基质干扰。因此,实验选择5 mL·L-1醋酸溶液-乙腈作为流动相体系。

3.2 检测波长的选择

取2.2.1项下特女贞苷对照品储备溶液,加甲醇稀释制成每1 mL 溶液中含有特女贞苷47.5 μg的溶液。取该溶液,设置液相色谱二极管阵列检测器扫描范围为200～400 nm,得特女贞苷最大吸收波长为225 nm;同法得蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的最大吸收波长分别为352、276 nm。由于3种目标物波长分布较广,无法采用单一检测波长进行定量检测,故实验选用波长切换法,即分别在3个波长下,对3种待测物进行定性、定量检测。结果见图2。

图2 典型光谱图Fig.2 Typical UV spectra

3.3 提取条件的优化

女珍颗粒供试品基质复杂,由10味药材组成,因此选择合适的提取条件对提高检测灵敏度、降低基质干扰等具有关键的作用。实验分别考察选择体积分数80%、85%、90%、95%的甲醇和甲醇对女珍颗粒供试品中特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的提取效果,结果显示选择甲醇时提取效果最佳。确定提取溶剂后,分别考察超声功率和超声时间对提取效果的的影响,最终确定最佳的提取条件为将甲醇作为提取溶剂,超声功率为200 W,时间为20 min。

综上所述,实验建立了测定女珍颗粒中特女贞苷、蟛蜞菊内酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的波长切换-超高效液相色谱法,对该方法的重复性、线性、回收率等进行了考察,并对前处理的条件进行了优化。结果表明,该方法具有快速、准确等特点,可用于女珍颗粒中成药的质量控制,为《中国药典》标准的提高提供技术参考。