miR-370-3p和FOXM1 mRNA对人成骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响观察及其靶向关系验证

王晓欣，刘红艳，朱兴

1 山东第一医科大学基础医学院，济南 250062；2 烟台市莱阳中心医院病理科；3 山东大学齐鲁医院（青岛）病理科

骨肉瘤是一种好发于青少年的恶性骨肿瘤［1］。目前无远端转移的骨肉瘤患者的五年生存率为70%，但发生远端转移患者的五年生存率仍然维持在20%左右［2］。因此，探寻骨肉瘤远端转移的具体发生机制及治疗靶点是目前的研究热点。微小RNA（miRNA）是一类含有18～25 个碱基的非编码单链RNA。miRNA 可通过与编码mRNA 的3’非翻译区（3’UTR）结合，干扰编码RNA 的翻译过程，甚至导致编码RNA 的直接降解［3］。miR-133a、miR-93等miRNA 的表达失调可能与骨肉瘤的发生相关，可用作预测骨肉瘤发生、评价预后的生物标志物［4］。研究［5-6］发现，miR-370-3p 在乳腺癌、胃癌、甲状腺癌等多种癌组织中异常表达，作为抑癌微小基因在肿瘤的发生、转移过程中发挥重要作用。但miR-370-3p在骨肉瘤发生及远端转移中的具体作用机制目前鲜有报道。我们前期通过TargetScan 软件预测miR-370-3p 的潜在靶基因，结果发现叉头框蛋白M1（FOXM1）可能是miR-370-3p的靶基因［7］。FOXM1是一个重要的转录因子，可参与调控细胞周期。研究［8］发现，许多中晚期癌组织中存在FOXM1 异常高表达，导致细胞周期调控失衡，抑制癌细胞的凋亡，促进癌细胞的侵袭和转移。2017年9月—2020年6月，我们观察了骨肉瘤组织中miR-370-3p、FOXM 1 mRNA 的表达变化，观察miR-370-3p 促进表达及FOXM1 抑制表达的人成骨肉瘤细胞系MG63 增殖、迁移及侵袭能力变化，验证MG63细胞中miR-370-3p与FOXM1的靶向关系。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 骨肉瘤组织miR-370-3p及FOXM1 mRNA表达观察

1.1.1 临床资料 选取2016 年4 月—2020 年5 月莱阳中心医院拟行肿瘤切除术的37例骨肉瘤患者，均经明确病理诊断为骨肉瘤，患者中男11 例、女26例，年龄≤18 岁27 例、>18 岁10 例；肿瘤直径≤50 mm者12 例，>50 mm 者25 例；根据国际抗癌联盟（UICC）指导标准确立TNM 临床分期为Ⅰ/ⅡA 期9例、ⅡB/Ⅲ期28例，远端转移27例。纳入者术前均未经过放化疗，患者或其家属已签署知情同意书。术中保存骨肉瘤及其癌旁组织。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.1.2 骨肉瘤及癌旁组织中miR-370-3p 及FOXM1 mRNA 检测 采用实时定量PCR（qRTPCR）法。 使用TRIzol 试剂（Life Technologies 公司）提取骨肉瘤及癌旁组织总RNA，用PrimeScript RT Reagent 试剂盒（TAKARA 公司）将1 μg 的RNA 逆转录成cDNA，miR-370-3p以U6作为内参，FOXM1 mRNA以β-actin 作为内参，引物由生工生物工程股份有限公司合成，FOXM1 正向引物：5’-CAGTCC‐GATTAGTCAGCTCCT-3’，反向引物：5’-GTCATT‐TAGCTCCTTGTGCTG-3’；β-actin 正向引物：5’-CT‐GATATAGCCGCGCTCG-3’，反向引物：5’-CACTCG‐GTGCCGGATCATCA-3’；miR-370-3p 正向引物：5’-ACACTCCAGCTGGGGCCTGCTGGGGTGGAACCCT -3’，反向引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6正向引物：5’-CCTGCTTCGGGAGCCCA-3’，反向引物：5’-ACCGCTCCACGTATTAGCGT-3’。采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TAKARA 公司）在StepOne‐PlusTM real-time PCR 系统（Applied Biosystems，Fos‐ter City，CA，USA），反应体系30 μL，反应条件：95 ℃持续30 s，95 ℃持续5 s，60 ℃持续30 s，72 ℃持续30 s，共40个循环。以2-ΔΔCt代表miR-370-3p和FOXM1 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.1.3 miR-370-3p 表达与骨肉瘤患者临床病理参数及预后的关系 通过Kaplan-Meier 曲线分析骨肉瘤与癌旁组织FOXM1 mRNA 表达与miR-370-3p 表达的相关性。收集37 例骨肉瘤患者的临床资料，包括年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分期及远处转移情况，根据骨肉瘤组织miR-370-3p 相对表达量，将miR-370-3p 分成高表达（>0.502）及低表达（≤0.502），采用Kaplan-Meier 曲线、Log-Rank 检验分析miR-370-3p 表达与骨肉瘤患者临床病理参数及预后的关系。

1.2 miR-370-3p过表达及FOXM1抑制表达的人成骨肉瘤细胞系MG63增殖、迁移及侵袭的影响

1.2.1 骨肉瘤细胞分组及miR-370-3p mimic、FOXM1 siRNA干扰质粒转染 将MG63（武汉普诺赛科技生命有限公司）细胞分为1～4组，2×104/孔接种于6孔板中，每组6个复孔。培养至待细胞贴壁率达到70%时，1～4组通过miR-370-3p mimic、mimic NC、空白对照组及FOXM1 siRNA 干扰质粒（上海吉玛基因公司）分别转染至细胞，继续培养48 h。

1.2.2 各组细胞增殖情况观察 采用CCK-8实验。取各组细胞，以2×103/孔接种到96 孔板中。将含有10%CCK-8（北京索莱宝公司）的培养基加入96 孔板，继续培养1 h，分别于转染0、24、48、72、96 h时在酶标仪中于450 nm 处测量各组光密度OD 值。以OD450 代表各组细胞的增殖能力，实验重复3 次，取平均值。

1.2.3 各组细胞迁移能力观察 采用划痕实验。取各组细胞，重悬后2×104/孔种植于6孔板中，使用无血清培养基培养24 h，使用100 μL移液管尖端与尺子于孔板底部平行划痕，分别于划痕0、48 h时于光学显微镜（200×）下观察拍照各组细胞的划痕愈合情况，测算划痕愈合率。实验重复3次，取平均值。

1.2.4 各组细胞侵袭能力观察 采用Transwell 小室。取40 μL 的Matrige 基质胶（1：4 稀释，美国密理博公司）均匀涂抹于预冷的Transwell 腔室上部，于培养箱孵育30 min。取各组细胞用无血清培养基重悬至2×105/mL，取300 μL 加入上部Transwell 腔室中，下室中加入20%胎牛血清培养基700 μL，于培养箱继续孵育24 h。于光学显微镜（200×）下观察细胞的侵袭情况，随机选择5个视野进行细胞计数。实验重复3次，取平均值。

1.3 MG63 细胞miR-370-3p 与FOXM1 靶向关系验证 miR-370-3p 与FOXM1 靶向结合能力观察 检索TargetScan 等数据库后发现miR-370-3p 与FOXM1 转录因子mRNA 的3’UTR 区域存在7 个连续的互补配对碱基，提示理论上miR-370-3p 能够与FOXM1 靶向结合。①pmirGLO-FOXM1-野生型/突变型质粒构建 将含有miR-370-3p 结合位点的FOXM1 片段扩增并克隆到双荧光素酶pmirGLO 载体中，获得pmirGLO-FOXM1-野生型（pmirGLOFOXM1-WT）质粒。利用QuikChange 定点突变试剂盒对FOXM1 中miR-370-3p 的假定结合位点进行突变，合成pmirGLO-FOXM1- 突变型（pmirGLOFOXM1-MUT）质粒。②MG63 细胞分组及pmirGLOFOXM1-WT/MUT、miR-370-3p mimc 质粒转染 调整MG63 细胞密度为5×103/孔，培养24 h 时将细胞分为4 组，每组6 个复孔。A、B、C、D 组分别用1 μL pmirGLO-FOXM1-WT+200 nmol miR-370-3p mimic、1 μL pmirGLO-FOXM1-WT + mimic NC、1 μL pmir‐GLO-FOXM1-MUT + 200 nmol miR-370-3p mimic、1 μL pmirGLO-FOXM1-MUT+200 nmol mimic NC 与脂质体Lipofectamine3000共转染。③各组细胞荧光活性观察 转染24 h 时根据说明书步骤，采用双荧光素酶报告检测系统测算各组荧光活性，荧光活性下降说明miR-370-3p mimc与FOXM1发生靶向结合作用，如无荧光活性改变则证明两者无靶向结合作用。实验重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组数据对比采用独立或配对样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。生存曲线分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比较采用Log-Rank检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤及癌旁组织miR-370-3p、FOXM1 mRNA表达

2.1.1 骨肉瘤及癌旁组织miR-370-3p、FOXM1 mRNA 相对表达量比较及其相关性 骨肉瘤组织miR-370-3p、FOXM1 mRNA 相对表达量分别为0.50 ± 0.28、2.26 ± 0.16，癌旁组织分别为1.26 ±0.21、1.63 ± 0.17。与癌旁组织比较，骨肉瘤组织miR-370-3p相对表达量低、FOXM1 mRNA 相对表达量高（t=4.66，3.41；P 均<0.05）。随miR-370-3p表达量升高，骨肉瘤组织FOXM1 mRNA表达量呈下降趋势（R2=0.6481，P=0.1284）。

2.1.2 miR-370-3p 表达与骨肉瘤患者临床病理参数及预后的关系 miR-370-3p表达与骨肉瘤患者年龄、性别、肿瘤直径无关（χ2=2.862、0.014、1.117；P均>0.05），与临床分期、远端转移情况有关（χ2=4.430、6.027；P均<0.05）。miR-370-3p 低表达的骨肉瘤患者预后比miR-370-3p 高表达患者差（P<0.05）。

2.2 各组细胞增殖、侵袭及迁移能力比较 转染0、24、48、72、96 h 时各组细胞OD450 值比较见表1。 1、2、3、4 组划痕愈合率分别为23.77% ±1.18%、50.02% ± 2.64%、51.73% ± 1.88%、24.17%±5.20%，与2、3 组相比，1、4 组划痕愈合率低（P 均<0.05）。1、2、3、4 组穿膜细胞数分别为91±9、157±11、163±9、95±7。与2、3组相比，1、4组穿膜细胞数少（P均<0.05）。

表1 质粒转染0、24、48、72、96 h时各组细胞OD450值比较（±s）

表1 质粒转染0、24、48、72、96 h时各组细胞OD450值比较（±s）

注：与3组比较，＊P<0.05；为与2组比较，ΔP<0.05。

组别转染72 h 0.798±0.05 ＊Δ 1.163±0.03 1.111±0.11 0.745±0.05 ＊Δ 1组2组3组4组转染96 h 0.933±0.07＊Δ 1.270±0.07 1.303±0.08 0.829±0.07＊Δ转染0 h 0.344±0.02 0.353±0.04 0.329±0.03 0.241±0.02转染24 h 0.498±0.03＊Δ 0.513±0.02 0.531±0.02 0.384±0.04＊Δ OD450值转染48 h 0.603±0.03＊Δ 0.830±0.03 0.837±0.03 0.594±0.08＊Δ

2.3 各组细胞荧光活性比较 转染24 h 时A、B、C、D 组细胞荧光活性分别为0.516 ± 0.105、1.004 ± 0.032、0.948 ± 0.06、1.015 ± 0.008。与B组比较，A 组细胞荧光活性降低（t=9.42，P<0.05）；与D 组比较，C 组细胞中荧光活性变化不明显（t=1.294，P=0.392）。

3 讨论

微小非编码RNA（miRNA）及其下游调控的功能性靶基因表达失衡是导致许多癌症发生重要因素之一。正常情况下，miRNA 在细胞的增殖分化过程中通过碱基互补配对靶向结合mRNA 的3’UTR 端来实现对mRNA 的翻译抑制或是降解的作用［9］。miR-370 在不同癌症的发生过程中扮演着双重角色的作用。作为致癌基因，WEI 等［10］通过qRTPCR 检测了41 例恶性黑色素瘤患者肿瘤组织及癌旁组织中miR-370 的表达水平，结果显示miR-370在肿瘤组织中表达明显高于癌旁组织，并且miR-370 的高表达与TNM 高分期有明显相关性，此外降低miR-370 的表达能够抑制恶性黑色素瘤细胞Sk-MEL-1 和A375 的增殖、侵袭及凋亡，同样miR-370 高表达能够在体内实验中促进裸鼠移植瘤的生长以及抑制其凋亡的发生，此表明miR-370 在恶性黑色素瘤中扮演着致癌基因的作用。作为抑癌因子，长链非编码RNACircMYO10 可以通过竞争性抑制miR-370-3p 促进骨肉瘤细胞的增殖及上皮间质转化，其主要机制为抑制miR-370-3p/RU‐VBL1 轴致使染色质重构促进肿瘤的发生［11］。本研究结果发现miR-370-3p 在骨肉瘤组织中表达相比于癌旁正常组织表达明显降低，miR-370-3p 的低表达与患者的高临床分期及远端转移有明显相关性。进一步研究发现，miR-370-3p 低表达患者预后生存要差于miR-370-3p 高表达的患者。外源性miR-370-3p 模拟物能够抑制骨肉瘤细胞系MG63 的增殖、迁移、侵袭能力，提示miR-370-3p 在骨肉瘤中扮演着抑癌基因的作用。

FOXM1是叉头框（forkhead box M1）蛋白家族成员之一，作为转录因子，FOXM1 参与多重细胞生物学调控过程，包括细胞周期过渡、有丝分裂纺锤体完整性的维护、血管生成、转移、凋亡和DNA 损伤修复［12］。HU等［13］研究发现FOXM1在肝细胞癌中过度表达能够激活下游驱动蛋白4A 导致肝癌细胞增殖。 LIN 等［14］研究表明FOXM1 能够激活AMPK/mTOR通路介导的自噬发生来促进前列腺癌细胞多西他赛耐药的发生。FOXM1 可通过调控三磷酸腺苷结合盒家族成员A8（ABCA8）参与骨肉瘤化疗耐药［15］。FOXM1 可能与ABCA8 启动子区域结合调控ABCA8 转录，用FOXM1 抑制剂Thiostrepton处理细胞或者shRNA 敲低ABCA8 的表达能够提高骨肉瘤耐药细胞对顺铂的敏感性。FOXM1 还可能通过调控DNA 修复基因Rad51 参与骨肉瘤细胞对顺铂的化疗耐药［16］。有研究［17］发现，miR-361-5p 靶向负性调控FOXM1 表达，单独沉默FOXM1 增加抗辐射骨肉瘤细胞株HOS-R 细胞的放射敏感性，FOXM1 可逆转miR-361-5p 对HOS-R 放射敏感性的促进作用。本实研究结果发现FOXM1 在骨肉瘤组织中的表达较癌旁正常组织中相比明显升高，干扰FOXM1的表达能够明显抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

通过线性回归分析37 例患者骨肉瘤组织中miR-370-3p 与FOXM1 的表达量（骨肉瘤/癌旁正常）变化发现，FOXM1 的表达量与miR-370-3p的表达量呈负相关，即为miR-370-3p 的表达量升高，FOXM1 的表达量呈下降趋势，提示miR-370-3p与FOXM1 可能有靶向调控关系，随后通过TargetScan 查找到miR-370-3p 与FOXM1 转录因子mRNA 的3’UTR 区域存在7 个连续的互补配对碱基，提示理论上miR-370-3p 能够与FOXM 转录因子靶向结合，miR-370-3pmimic 能够抑制FOXM1野生型3’UTR 报告基因质粒的荧光酶活性，但无法抑制FOXM1 突变型报告基因质粒的荧光酶活性，MG63 细胞中过表达miR-370-3p 可以下调FOXM1 的蛋白表达。以上提示miR-370-3p 可通过靶向结合FOXM1 的3’UTR 端来抑制FOXM1 的基因表达，从而抑制骨肉瘤细胞MG63 的迁移、侵袭、增殖。

综上所述，骨肉瘤组织中miR-370-3p 表达下降、FOXM1 mRNA 表达升高。上调miR-370-3p表达及抑制FOXM1 表达的MG63 细胞的增殖、迁移、侵袭能力均降低。miR-370-3p 可能通过靶向抑制MG63细胞FOXM1表达发挥肿瘤抑制作用。