木尼孜其对加入顺铂培养的大鼠卵巢颗粒细胞性激素分泌及增殖调控作用观察

刘莉，杨银银，夏米西努尔·伊力克

新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830054

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）又称原发性卵巢功能不全，是指40岁以下的女性绝经后血清卵泡刺激素（FSH）>40 IU/L，继发闭经≥4个月。POF 的临床症状包括无排卵、闭经、并伴有FSH和LH 水平升高，E2 水平降低［1］。卵巢颗粒细胞（Granulosa cells，GC）是一种起源于卵巢性索的体细胞［2］，能够支持发育中的卵母细胞产生类固醇激素和各种生长因子。GC 可以合成并分泌大量的E2，E2 对卵泡的发育起着负反馈的作用，并且能够影响FSH、LH 分泌水平。顺铂（cisplatin，CP）是目前临床上最有效的化疗药物之一［3］。当卵巢GC 发生化疗性损伤时，体内的FSH 和LH 水平升高，E2 水平降低。因此检测GC 损伤后FSH、LH 和E2 的分泌水平可以侧面的反应POF 的严重程度。由于女性性腺对抗肿瘤药物敏感度较高，CP 在治疗肿瘤的同时可造成女性卵巢功能损伤，部分患者会进展为不可逆POF［4］。我们前期研究［5］发现，中药木尼孜其可调解人体免疫力，降低炎症水平，已用于痛经、更年期综合征、盆腔炎等疾病的治疗中。木尼孜其在化疗性POF 中的作用及其具体机制尚不清楚。2020 年11月—2022 年1 月，我们从大鼠卵巢组织分离颗粒细胞，观察木尼孜其对加入CP培养的大鼠颗粒细胞性激素分泌及细胞增殖的调控作用，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 5～6 周龄的雌性SD 大鼠60 只，体质量（200 ± 10）g；3 周龄的雌性SD 大鼠10只，体质量（60±10）g。大鼠均购买自新疆医科大学动物实验中心。购买自新疆医科大学动物实验中心。胎牛血清购自美国Gibco 公司；DME/F12 培养基（购自美国Hyclone）；青霉素、链霉素购自美国Hyclone；孕马血清促性腺激素购自Solarbio 公司；CCK-8；卵泡刺激素受体（FSHR）购自美国Bioword公司；CP 购自Solarbio；ELISA 试剂盒购自Elab‐science 公司；木尼孜其（主要由小茴香、甘草、红葡萄、无花果干、玫瑰花瓣等制成的中药合剂）购自新疆乌鲁木齐维吾尔自治区医院；EpsonLX-800 酶联免疫检测仪；超净台；倒置显微镜；恒温培养箱。

1.2 木尼孜其血清制备 将60 只5～6 周龄大鼠适应性喂养1周，随机分为木尼孜其高、中、低剂量组，每组20只，木尼孜其高、中、低剂量组分别用木尼孜其合剂7.6、3.8、1.9 毫升/只灌胃，早晚各1 次，共灌胃7 d。第7 天早上将2 次剂量一次性灌胃，灌胃结束1～2 h 内采集三组大鼠腹主动脉，将同组大鼠血液混合，3 000 r/min离心20 min，获取高、中、低剂量木尼孜其血清，-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 大鼠卵巢颗粒细胞制备

1.3.1 大鼠卵巢颗粒细胞分离 取3 周龄大鼠10只，适应性喂养1周。皮下注射孕马血清促性腺激素（PMSG）50 IU/只。注射48 h 时处死大鼠，分离卵巢组织并清洗，用1 mK的注射器针头刺破卵泡释放细胞，收集细胞悬液。在卵巢组织中加入0.25%的胰蛋白酶中消化60 min，消化结束后用滤网过滤，收集细胞悬液。将上述两种细胞悬液混合后1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS 洗涤收集沉淀后再次离心。用含有10%胎牛血清的培养基重悬离心后细胞沉淀，在37 ℃、5%CO2条件下培养颗粒细胞，48h 后进行细胞换液。

1.3.2 大鼠卵巢颗粒细胞鉴定 FSHR 特异性表达于雌性动物卵巢颗粒细胞［5］，故采用免疫荧光法检测细胞FSHR，从而鉴定卵巢颗粒细胞。将“1.3.1”中分离细胞接种至6 孔板中，待细胞生长密度达到80%左右时，PBS 洗涤3 次，加入4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，PBS 洗涤细胞，加入PBS 稀释的5%TritonX-100，室温静置30 min。加入山羊血清工作液（按照说明书稀释）室温封闭30 min，弃血清并沥干（此处不用PBS 清洗）。加入500 μL/孔的FSHR 一抗（1∶200 稀释），4 ℃冰箱孵育过夜。次日加入500 μL/孔的FITC 山羊抗兔二抗，37 ℃恒温箱中静置1 h，静置结束后用PBS 洗涤。避光滴加500 μL/孔的DAPI 染色液（1∶1 000 甲醇稀释），避光静置10 min，PBS 清洗后沥干PBS 残液。每孔加入300 μL的抗荧光淬灭封片剂，最后在荧光显微镜下随机选取5 个视野测算大鼠卵巢颗粒阳性细胞数。5 个视野下大鼠卵巢颗粒细胞阳性率均>90%，判定成功分离卵巢颗粒细胞。

1.4 大鼠卵巢颗粒细胞分组及木尼孜其血清给予方法 取大鼠卵巢颗粒细胞，接种到6孔板中，分为3组，1组18个复孔，2、3组各6个复孔。当细胞生长密度达到90%左右时，其中1、2组加入5 μg/mL的CP培养48 h［6］，培养后1组再分为三个亚组，分别加入高、中、低剂量木尼孜其血清培养。2组为CP组，3组为正常对照组，均用含有10%胎牛血清的培养基培养。

1.5 各组大鼠卵巢颗粒细胞FSH、LH 和E2 检测 采用ELISA 法。培养48 h 时取各组细胞培养液，ELISA 法检测细胞培养液FSH、LH 和E2。所有操作均严格按照使用说明书进行。实验重复3 次，取平均值。

1.6 各组大鼠颗粒细胞增殖情况观察 采用CCK-8法。分别于培养24、48、72、96 h 时，取各组细胞，200 μL 的PBS 清洗细胞，加入10%胎牛血清的培养基和CCK-8 的混合液100 μL（10%胎牛血清的培养基：CCK-8=100∶1），培养2 h用酶标仪读取450 nm波长处的光密度值（OD450 值）。实验重复3 次，取平均值。

1.8 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件进行数据处理。采用Shapiro-Wilk 检验验证数据的正态性，符合正态分布的计量资料采用±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠卵巢颗粒细胞培养液FSH、LH、E2水平比较 各组大鼠卵巢颗粒细胞培养液FSH、LH、E2水平比较见表1。

表1 各组大鼠卵巢颗粒细胞培养液FSH、LH、E2水平比较（pg/mL，±s）

表1 各组大鼠卵巢颗粒细胞培养液FSH、LH、E2水平比较（pg/mL，±s）

注：与3 组比较，*P<0.05；与2 组比较，#P<0.05；与低剂量木尼孜其者比较，＆P<0.05；与中剂量木尼孜其比较，ΔP<0.05。

组别1组高剂量木尼孜其中剂量木尼孜其低剂量木尼孜其2组3组FSH LH E2 2.66±0.14#＆Δ 2.03±0.04 2.33±0.11 0.25±0.11*1.72±0.06 57.92± 1.25#＆Δ 59.21± 2.28 76.67± 3.00 511.66±381.48*89.95± 1.23 4.43± 3.68#＆Δ 5.36± 3.78 4.54± 3.28 74.03±37.62*18.41± 7.05

2.2 培养24、48、72 及96 h 时各组卵巢颗粒细胞OD450 值比较 培养24、48、72、96 h 时各组卵巢颗粒细胞OD450值比较见表2。

表2 培养24、48、72及96 h时各组卵巢颗粒细胞OD450值比较（±s）

表2 培养24、48、72及96 h时各组卵巢颗粒细胞OD450值比较（±s）

注：与3组比较，*P<0.05；与2组比较，#P<0.05；与低剂量木尼孜其者比较，＆P<0.05；与中剂量木尼孜其比较，ΔP<0.05。

组别1组高剂量木尼孜其中剂量木尼孜其低剂量木尼孜其2组3组OD450值培养24 h 培养48 h 培养72 h 培养96 h 0.630±0.033#＆Δ 0.340±0.020 0.520±0.025 0.180±0.005*0.480±0.031 0.860±0.034#＆Δ 0.460±0.020 0.350±0.021 0.430±0.014*0.590±0.013 1.170±0.054#＆Δ 0.550±0.045 0.800±0.065 0.310±0.013*0.640±0.034 0.800±0.064#＆Δ 0.500±0.033 0.650±0.082 0.250±0.007*0.600±0.027

3 讨论

化疗是临床上常用的治疗癌症的手段，CP 作为临床上常用的化疗药物在杀死癌细胞的同时常常伴随着对正常组织，特别是分裂细胞的损伤。CP 可以对原始卵泡产生直接的毒性，可能会导致原始卵泡丢失，导致卵巢储备枯竭，从而导致POF 的发生［6-7］。研究［8］发现，卵巢GC 负责传递内分泌激素以及细胞信号分子，从而来促进卵母细胞的发育和成熟，卵巢GC作为卵泡闭锁的始动细胞，发生凋亡的时间早于卵母细胞和卵泡膜细胞，大量的卵巢GC 凋亡会影响卵泡的发育和成熟。卵巢GC 能够分泌性腺激素来维持卵巢功能，卵巢GC 的增殖和凋亡与卵巢的功能密切相关。本实验以5 μg/mL顺铂干预体外培养的卵巢GC来模拟卵巢早衰GC。

在本次研究中，成功分离并培养了GC，并成功建立了原代卵巢GC 体外培养体系。通过参考文献［9-10］中的方法，获取数量较多且细胞纯度较高的GC。刚提取出的原代卵巢GC，培养至24 h，细胞长出短小的伪足，开始贴壁生长，此时处于贴壁适应期生长速度相对慢；48 h～72 h 细胞的吸光度值明显增加，此时细胞开始大量的增殖，可以判断颗粒细胞从48 h开始进入对数生长期，72 h吸光度值达到顶峰，72 h 后吸光度值没有增加说明细胞进入平台期，96 h 后细胞的吸光度值开始下降，说明细胞开始死亡。FSHR是一种G蛋白耦联受体，特异表达在卵巢GC 的细胞质中［11-12］，因此本实验采用FSHR 免疫荧光鉴定提取的卵巢GC，发现提取培养的细胞的FSHR的阳性率>90%，符合细胞实验的要求。

木尼孜其是一种从中草药混合物中提取的水提物，主要由小茴香、甘草、红葡萄、无花果干、玫瑰花（瓣）等制成的中药合剂，能够调节机体的稳态平衡［13］。木尼孜其可以有效的调节机体内激素的合成以及代谢，减少线粒体的氧化和脱氧核糖核酸的损伤，治疗内分泌紊乱引起的痤疮、黄褐斑、痛经、更年期综合征以及女性的生殖系统的炎症［14-16］。由于中药本身的成分多样，组成较为复杂，对中药作用机制的研究目前较少。针对中药直接作用体外实验研究的困难性，在20世纪80年代，日本学者Hiroko lwama首次提出了血清药理学的这个概念，并开始用于药效的评价以及中药相关作用的研究［17］。目前药理血清的实验技术日趋于成熟，在心血管系统、呼吸系统、生殖系统、抗炎、抗菌、抗病毒等的研究中被广泛的应用［18］。

在前期实验中发现用木尼孜其干预慢性应激卵巢早衰的大鼠一段时间后，大鼠卵巢的分泌功能得到改善［19］。因此本实验得到前期实验的启发，探讨木尼孜其含药血清对卵巢GC 分泌的性激素FSH、LH 和E2 的影响。FSH 和LH 是由同一个α-亚基（AGSu）组成的二聚体糖蛋白，并且还是与促甲状腺激素和人绒毛膜促性腺激素同属一类的异二聚体糖蛋白［20］。FSH 和LH 通过控制所有脊椎动物的性腺发育和成熟，在脑-垂体-性腺（BPG）轴中发挥重要作用。FSH 在雌性配子发生、精原细胞增殖和卵黄发生的早期阶段起重要作用，而LH 主要参与雌性最终配子的发生、雌性卵母细胞成熟和排卵以及雄性精子发生和精子形成的过程。机体内FSH和LH 含量的多少是卵巢活动的决定因素［21-22］。在卵巢GC中，FSH 刺激卵泡的发育，LH 参与卵泡的发育和成熟，并且依赖FSH 和LH 的协同作用调节卵泡形成、GC的生长、排卵触发等。FSH 和LH 的缺陷降低了配子的发生和性腺类固醇的产生，从而降低了女性的生育力。在卵泡膜细胞中，LH刺激雄激素的分泌，雄激素被转移到卵巢GC，通过芳香化酶转化为E2。E2现已被确认为是一种卵巢激素，并且是评估排卵前状态的“金标准”，密切反映卵泡的发育和排卵的方式［23-25］。在卵泡早期，FSH 水平的增加，触发了E2 的分泌，而E2 的大量分泌又反过来抑制FSH 的释放。在卵泡晚期，LH 水平升高，刺激E2 的分泌，在月经周期的中期，E2 向下丘脑提供正反馈，引起FSH 和LH 的激增［26］。实验中用5 μg/mL 的CP干预细胞48 h，建立卵巢GC 早衰模型，然后用不同浓度的木尼孜其含药血清作用相同时间，2组与3组相比较，FSH 和LH 的水平升高而E2水平下降，说明CP 能够造成卵巢GC的损伤。而木尼孜其含药血清高剂量组与模型组相比较，FSH和LH的水平下降而E2 水平升高，说明高剂量的含药血清对损伤的卵巢GC有一定改善作用。进而可以说明木尼孜其对卵巢GC 的分泌功能有一定的改善作用。用5 μg/mL 的CP 干预细胞48 h，建立化疗性卵巢早衰的GC 模型，用CCK-8法比较不同浓度的木尼孜其含药血清对CP损伤卵巢GC增殖能力的影响。结果提示：CP损伤卵巢GC后，用不同浓度木尼孜其含药血清作用不同时间，发现模型组与正常对照组相比较，模型组细胞的OD 值减少。用不同浓度木尼孜其含药血清分别作用于受损的卵巢GC后，发现各个剂量的木尼孜其含药血清都能促进卵巢GC 的生长；其中高剂量（7.6 mL/只灌胃剂量）的含药血清效果最好，并且随着含药血清浓度的增高，细胞的增殖率升高的越显著。说明木尼孜其含药血清对损伤的卵巢GC 的增殖能力有一定改善作用。但是本实验仅是通过体外实验来探讨木尼孜其对卵巢早衰GC 分泌性激素的功能以及对细胞增殖能力的影响，因此还有待更多的体内实验进行验证。

综上所述，木尼孜其可抑制顺铂培养的大鼠颗粒细胞FSH、LH表达、促进E2表达，木尼孜其可促进顺铂培养的大鼠颗粒细胞的增殖，并且木尼孜其浓度越高对细胞的增殖效果越明显。因此在本研究中7.6 mL/只灌胃剂量的木尼孜其对加入顺铂培养的大鼠卵巢颗粒细胞性激素分泌及增殖调控作用最佳。