中药厚朴发汗过程中微生物群落结构及特征的分析*

李玉平，严春兰，骆进程，林 昶，杨长福

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

厚朴始载于《神农本草经》，是我国传统的芳香化湿药，具有燥湿消痰、下气除满的功效，用于湿滞伤中，脘痞吐泻，食积气滞，腹胀便秘等症[1]。厚朴主要含厚朴酚、厚朴酚[2]、挥发油[3-4]、厚朴碱[5]等。厚朴酚及和厚朴酚具有抗肿瘤[6]、抗抑郁[7]、抗炎[8]等作用。《中国药典》要求对厚朴进行“发汗”炮制加工。“发汗”是中药一种传统增效的产地加工方法。“发汗”类似于发酵，且“发汗”后样品的质量均有所提升[9]。多个研究表明“发汗”后厚朴药理作用更强[10]。因此，“发汗”后的厚朴药材通常被认为是质量上乘的重要体现[11]，是厚朴增效的炮制过程。

迄今为止，已有研究多通过检测“发汗”前后有效成分的变化情况，进而判断“发汗”的必要性，然而有关厚朴“发汗”机理的报道很少。“发汗”可通过厚朴鲜树皮置沸水中微蒸、煮后堆积放置或鲜树皮直接堆积放置等方式使药材发热、“回潮”，药材内部水分外溢，从而产生一个湿热的环境[12]。研究表明，湿热环境有利于微生物的生长繁殖[13]，厚朴在“发汗”过程中，随着温湿度的改变，微生物群落结构和多样性随之产生变化。不同方式“发汗”后厚朴药材质量均得到提高[14]。魏担等[15]对厚朴鲜树皮置沸水中微蒸后“发汗”的菌群变化情况进行了研究，但将厚朴鲜树皮直接堆积放置“发汗”的菌群多样性及特征变化情况如何，以及与微蒸后“发汗”菌群变化是否一致，目前仍不知晓。为此，采用高通量扩增测序技术探索厚朴鲜皮直接“发汗”过程中微生物群落多样性及其特征，旨在进一步寻找影响厚朴药材质量的微生物群落，为推进厚朴的精准“发汗”提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 厚朴样品于2019年6月采集于贵州省遵义市习水县杉王街道羊九村(北纬28°36'东经106°21')，选取3株树龄18年厚朴植株，剥取厚朴干皮，趁鲜带回实验室，经贵州中医药大学林昶副教授鉴定为厚朴M.officinalis，并于洁净实验室的超净工作台(紫外灯照射30min)内用铡刀(紫外灯全方位照射30 min)无菌操作将其切成长4 cm，宽2 cm小块，然后对切块进行混均，随机取其中3份厚朴新鲜干皮作为“发汗”前样本(Q1-Q3)，剩余切块装于无菌黑色塑料袋置于阴凉处进行“发汗”并于第3 d随机取3份样本(Z1-Z3)、第6 d随机取3份样本(H1-H3)，取样分别装于9个无菌取样袋中，每次样本取完后立即放入-80 ℃冷冻备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提和PCR扩增 厚朴“发汗”过程中样品的真菌ITS区以及细菌V3～V4区基因测序，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。根据E.Z.N.A.® soil试剂盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。

真菌扩增区域为ITS1区，引物为ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')[16]。用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-33')和806R(5'-GGACTACHVGGGTTCTAAT-3')引物对细菌V3-V4可变区进行PCR扩增[17]，扩增程序为：95℃预变性3min，真菌35个循环/细菌27个循环(95℃变性30 s，真菌53℃/细菌55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸10 min(PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型)。扩增体系为20 μL，4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5mM dNTPs，0.8 μL 引物(5uM)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.2.2 Illumina Miseq测序 使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-STPromega进行检测定量。根据Illumina MiSeq 平台(Illumina，San Diego，USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。构建文库步骤：(1)连接“Y”字形接头。(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段。(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集。(4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

1.2.3 数据处理 原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，使用FLASH软件进行拼接：(1)设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口前端位置截去该碱基后端所有序列，之后再去除质控后长度低于50 bp的序列。(2)根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接，拼接时overlap之间的最大错配率为0.2，长度需大于10 bp。去除无法拼接的序列。(3)根据序列首尾两端的barcode和引物将序列拆分至每个样本，barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除存在模糊碱基的序列。使用的UPARSE软件(version 7.1 http：//drive5.com/uparse/)，〗根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier(http：//rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库(SSU123)，设置比对阈值为70%。

1.2.4 数据处理及统计分析 测序数据放在上海美吉生物医药科技有限公司的美吉生信云分析平台(https：//cloud.majorbio.com)进行分析。MiSeq测序得到的双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向。将高质量的序列按照97%相似性进行OTU(operational taxonomic unit)聚类。选择所有的样品统一按最小样本序列数进行抽平分析，利用Chao和Shannon进行alpha多样性指数分析，用主坐标分析(PCoA)进行beta多样性指数分析。选择分析平台提供的Student、st-test差异检验方法进行alpha多样性指组间差异检验，用ANOSIM差异检验方法进行主坐标分析(PCoA)的差异进行统计分析。利用求均值的样本分组计算方法绘制群落柱形图和群落饼图进行门水平上菌群组成变化分析。利用求均值的样本分组计算方法绘制群落柱形图，用Average的物种层级聚类和求均值的样本分组计算方法绘制群落物种聚类树Heatmap图共同进行属水平上菌群结构及变化分析。

2 结果

2.1 alpha多样性分析 由分析结果(图1)可知，对于真菌，“发汗”中样品(ZZ)具有最高的 Chao 指数(139.85)，说明“发汗”中物种丰度最高，“发汗”前样品(ZQ)和发汗”中样品与“发汗”后样品(ZH)物种丰度差异有统计学意义，说明“发汗”后真菌的物种丰度下降明显。“发汗”中样品具有最高的Shannon指数(2.46)，反映“发汗”中物种多样性最高。且与“发汗”前样品和发汗”后样品差异有统计学意义。

样本中细菌的Chao指数相对真菌而言较小，说明厚朴“发汗”过程中细菌的物种丰度低于真菌，且“发汗”中样品(XZ)和发汗”后样品(XH)物种丰度相对“发汗”前样品(XQ)变小，但差异无统计学意义。细菌Shannon指数同样小于真菌Shannon指数，说明厚朴“发汗”过程中细菌的多样养性低于真菌，且“发汗”后样品物种多样性小于“发汗”前样品和发汗”中样品，但差异无统计学意义。

注：0.01

2.2 微生物群落结构及变化情况

2.2.1 “发汗”过程中微生物门水平群落结构及变化情况 根据高通量测序结果，从9份供试样本中共检测到6个真菌菌门，分别为子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota，未分类的真菌门Unclassified_k_Fungi、接合菌门Zygomycota、壶菌门Chytridiomycota和隐真菌门Rozellomycota，见图2。子囊菌门Ascomycota在“发汗”整个过程中处于绝对优势地位。担子菌门Basidiomycota、未分类的真菌门unclassified_k_Fungi和接合菌门Zygomycota在“发汗”中丰度明显升高。壶菌门Chytridiomycota和隐真菌门Rozellomycota仅在“发汗”中出现，且丰度极小。可见“发汗”这一过程促进了在“发汗”中丰度变高或出现的菌门的繁殖，为其转化厚朴提供了条件。我们寻找在“发汗”中发挥作用的真菌时，可以把范围缩小到担子菌门Basidiomycota、未分类的真菌门unclassified_k_Fungi、接合菌门Zygomycota、壶菌门Chytridiomycota和隐真菌门Rozellomycota。

共检测到10个门水平细菌，由变形菌门Proteobacteria、蓝藻门Cyanobacteria、厚壁菌门Firmicutes、浮霉菌门Planctomycetes、放线菌门Actinobacteria、未分类细菌门Unclassified_k_norank、酸杆菌门Acidobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、装甲菌门Armatimonadetes及Saccharibacteria门组成。“发汗”各阶段门水平上的细菌群落结构见图3，变形菌门Proteobacteria在整过“发汗”过程中处于绝对优势地位且在中后期丰度进一步提高。浮霉菌门Planctomycetes、酸杆菌门Acidobacteria、装甲菌门Armatimonadetes及Saccharibacteria门在“发汗”中后期消失，且整过“发汗”过程中无新增优势菌门出现。由细菌菌门变化情况可知，“发汗”并没有为功能菌的菌门创造适宜的条件，故判断在“发汗”过程中发挥作用的微生物并不是细菌。

图2 不同时期门水平上真菌样本群落组成及变化分析

图3 不同时期门水平上细菌样本群落组成及变化分析

2.2.2 “发汗”过程中微生物属水平组成及丰度变化情况分析 厚朴“发汗”过程中9个样本共检出167个真菌菌属。按总丰度递减排列，前5的真菌属是青霉菌属Penicillium、假丝酵母菌属Candida(Meyerozyma)、Unclassified_p_Ascomycota、曲霉属Aspergillus、Unclassified_c_Leanororcete。由图4丰度热图可知，进化关系越近的菌属，在“发汗”过程中丰度变化情况越相似。分支Unclassified_f_Davidielaceae、隐球菌属Cryptococcus、链格孢属Alternaria、Unclassified_c_Leanororcete、Unclassified_f_norank和Unclassified_o_Capnodiales中除了Unclassified_c_Leanororcete外，在“发汗”过程中都是由低丰度到高丰度再到低丰度的变化。分支Unclassified_k_fungi、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis和葡萄座腔菌属Neofusicoccum中，丰度都是“发汗”前和“发汗”中丰度较高，“发汗”后丰度变小。分支Toxicocladosporium、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae、小囊菌属Microascus、红冬孢酵母属Rhodosporidium和黑星菌属Venturia中，丰度都是“发汗”中变高，“发汗”前和“发汗”后丰度都很低。分支镰刀菌属Fusarium和Unclassified_f_Ramalinaceae在“发汗”过程中丰度逐渐变低。分支假丝酵母菌属Candida(Meyerozyma)和曲霉属Aspergillus在“发汗”整个过程中丰度不断变高。分支青霉菌属Penicillium和Unclassified_p_Ascomycota中，青霉菌属Penicillium在“发汗”中丰度低于“发汗”前和“发汗”后，Unclassified_p_Ascomycota在“发汗”整个过程中丰度不断降低。

图4 真菌在属水平上的组成及丰度变化情况

“发汗”过程中9个样本共检出50个细菌菌属，按总丰度递减排列，前5的细菌菌属是泛菌属Pantoea、肠杆菌属Enterobacter、假单胞菌属Pseudomonas、Norank_c_Cyanobacteria、沙雷氏菌属Serratia。由图5细菌丰度热图可知进化关系越近的菌属，在“发汗”过程中丰度变化情况也越相似。分支norank_c_Cyanobacteria、泛菌属Pantoea和肠杆菌属Enterobacter中，只有norank_c_Cyanobacteria“发汗”过程中丰度逐渐降低，泛菌属Pantoea和肠杆菌属Enterobacter丰度几乎保持不变。分支乳球菌属Lactococcus、Bryocella、norank_f_ODP1230B8.23、Unclassified_k_ norank、Singulisphaera和norank_o_Acidimicrobiales中，各菌属丰度均在降低。分支假单胞菌属Pseudomonas、单胞菌属Stenotrophomonas、沙雷氏菌属Serratia、Rosenbergiella、塔特姆菌属Tatumella和新鞘脂菌属Novosphingobium中，各菌属丰度几乎保持不变。分支鞘脂菌属Sphingobium、无色杆菌属Achromobacter、葡糖杆菌属Gluconobacter、Unclassified_f_Enterobacteriaceae和藤黄色杆菌属Luteibacter中，虽然在中后期丰度都有所上升，但丰度都很低。分析结果进一步支持“发汗”中发挥作用的是真菌而非细菌。

图5 细菌属水平组成及丰度变化情况

3 讨论

本实验样本中共检测到6个真菌菌门，子囊菌门Ascomycota在“发汗”整个过程中处于绝对优势地位。担子菌门Basidiomycota、未分类的真菌门unclassified_k_Fungi和接合菌门Zygomycota在“发汗”中丰度明显升高。壶菌门Chytridiomycota和隐真菌门Rozellomycota仅在“发汗”中出现，且丰度极小。可见“发汗”这一过程促进了在“发汗”中丰度变高或出现的菌门的繁殖，为其转化厚朴提供了条件。所以在寻找 “发汗”中发挥作用的真菌时，可以把范围缩小到担子菌门Basidiomycota、未分类的真菌门unclassified_k_Fungi、接合菌门Zygomycota、壶菌门Chytridiomycota和隐真菌门Rozellomycota。共检测到10个门水平细菌，变形菌门Proteobacteria在整过“发汗”过程中处于绝对优势地位且在中后期丰度进一步提高。浮霉菌门Planctomycetes、酸杆菌门Acidobacteria、装甲菌门Armatimonadetes及Saccharibacteria门在“发汗”中后期消失，且整个“发汗”过程中无新增优势菌门出现。

实验结果显示厚朴鲜树皮直接堆积放置“发汗”的过程中真菌物种丰度在“发汗”中最高，且“发汗”前和“发汗”中都高于“发汗”后，差异有统计学意义。“发汗”中真菌物种多样性最高，且与“发汗”前和“发汗”后样品差异有统计学意义，故真菌物种丰度和多样性在整个“发汗”过程中均为先上升后下降，且“发汗”后真菌物种丰度和多样性在整个“发汗”过程中最低。“发汗”过程中的细菌物种丰度和多样性均低于真菌，“发汗”前中后期细菌物种丰度和多样性差异无统计学意义。这与魏担等[15]将厚朴鲜树皮置沸水中微蒸后“发汗”的真菌最后物种丰度和多样性均下降具有一致性，但魏担等微蒸后“发汗”的过程中细菌丰度和多样性均高于真菌，这与本实验结果相反，这可能与微蒸处理后改变了厚朴初始菌群结构有关，也有可能是采集厚朴地方或“发汗”环境不同造成的。另外本实验还注意到进化关系越近的菌属，在“发汗”过程中丰度变化情况也越相似。这可能是越相近的菌属对生存环境的适应性越相似的原故。

厚朴主要有效成分厚朴酚与和厚朴酚[18-19]，能够作为评价指标反映厚朴质量。王颖[20]利用在厚朴中分离到的真菌摇瓶发酵发现曲霉属、毛霉属、木霉属、镰刀菌属、交链孢霉属、粘帚霉属和蜡蚧菌属都能提高厚朴酚的产量。这与本实验及魏担等微蒸后“发汗”后的优势真菌菌属的差异较大，但均能对厚朴药材起到增效作用[14]这一结果不矛盾。

“发汗”会提高中药厚朴药材质量，本人认为，“发汗”会给发挥作用的菌属创造适宜的繁殖条件，从而使其丰度升高。故发挥作用的应该是真菌而非细菌，且在“发汗”中发挥作用的真菌属应该在Unclassified_f_Davidielaceae、隐球菌属Cryptococcus、链格孢属Alternaria、Unclassified_f_norank、Unclassified_o_Capnodiales、Toxicocladosporium、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae、小囊菌属Microascus、红冬孢酵母属Rhodosporidium和黑星菌属Venturia这些在中后期丰度升高的菌属中寻找。综上，本实验分析了鲜皮厚朴直接堆积放置 “发汗”过程中的微生物群落结构及特征，对进一步寻找厚朴“发汗”过程中发挥作用的菌属具有一定参考价值。