电针对IBS-D模型大鼠结肠组织中PAR-2表达的影响*

郑淑霞，许金森，陈苑平，陈 柯，萨喆燕，潘晓华

(福建省中医药科学院经络研究所/福建省经络感传重点研究室，福建 福州 350003)

腹泻型肠易激综合征(diarrhoeal irritable bowel syndrome，IBS-D)是临床最为常见的功能性胃肠病之一，因其症状迁延不愈，复发率高，严重影响患者生活质量，成为当前研究的热点[1-2]。已有临床和实验研究[3-5]证实，针刺对IBS-D有较好的治疗效果，能显著改善IBS-D患者腹痛、腹泻等肠道症状，恢复肠道功能。近年来，国内外研究发现PAR-2介导的信号通路在IBS的发病机制中起到重要影响，不仅参与胃肠道的运动功能，还可调节内脏的敏感程度，且越来越多的研究发现PAR-2在肠道黏膜通透性中亦起到重要作用。然而针刺对IBS-D肠道功能的调节作用是否与PAR-2有关，目前尚未有深入研究。因此本研究观察了IBS-D模型大鼠结肠组织PAR-2 mRNA及蛋白表达的变化，探讨电针干预IBS-D的可能机制，为电针治疗IBS-D提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康成年的雄性SD大鼠32只，体质量(250±20)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司动物提供(许可证号：SCXK(沪)2018-0006)。适应性饲养于福建省中医药科学院实验动物中心7 d后分组饲养，温度为(23～26)℃，相对湿度为50%～70%。

1.2 实验试剂及仪器 番泻叶生药(亳州市华鑫中药饮片科技有限公司)，液体石蜡(运加牌，黑龙江省运加医疗科技有限公司)，AG RNAex Pro RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、SYBR® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)，PAR-2一抗(英国 Abcam公司)，GAPDH一抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(H+L)(北京博奥森生物技术有限公司)，8FR导尿管(事达牌，湛江市事达实业有限公司)，2 mL注射器(康友牌，江苏康友医用器械有限公司)，电子秤(福建福日电子股份有限公司)，R407小动物呼吸麻醉系统(瑞沃德生命科技有限公司)，异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)，SDZ-Ⅱ型电针仪(华佗牌，苏州医疗用品厂有限公司)，0.25 mm×13 mm无菌针灸针(华成牌，苏州东邦医疗器械有限公司)，NANODROP RNA质量检测仪(美国Thermo公司)，Veriti梯度PCR仪(美国ABI公司)，ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，冷冻高通量组织研磨仪(浙江美壁仪器有限公司)。

1.3 分组与造模 32只大鼠适应性饲养7 d后，随机分成对照组、对照电针组、模型组及模型电针组，每组8只。对照组、对照电针组大鼠正常喂养，余下2组则需进行2w的IBS-D造模处理。参照Williams等[6]的方法进行改进，采用慢性束缚应激联合番泻叶灌胃的方法建立IBS-D大鼠模型，并参照赵妍等[7]的方法制备0.3 g/mL的番泻叶煎剂。造模时先给予番泻叶煎剂(0.3 g/mL)，并按照10 mL/kg的给药剂量灌胃。灌服番泻叶煎剂后，将大鼠装进自制的固定器中，限制其无法进行自如活动，持续时长为1h，每日1次，持续2w。以模型组大鼠腹泻指数与大便Bristol评分、直结肠扩张(colorectal distension，CRD)容量阈值与空白组差异具有统计学意义为造模成功的标准。

1.4 干预方法 对照电针组和模型电针组在造模成功后对大鼠的足三里穴进行电针干预，将大鼠固定在自制固定器内，使其不乱跑乱动，参照实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》，选取大鼠的足三里穴。选用规格为0.25 mm×13 mm的毫针直刺，深度约为5 mm，并接上电针仪，选用疏密波，频率2 Hz，强度为1～2 mA，以大鼠下肢出现轻微抖动且不嘶叫为度，留针20 min，每日1次，持续7d。

1.5 观察指标和检测方法

1.5.1 一般情况 观察大鼠在实验过程中的精神状态、活动情况、毛发光泽度以及体重增长等情况。

1.5.2 腹泻情况 在大鼠造模前后以及干预后，对所有大鼠进行腹泻指数的测算。腹泻指数测定时在鼠笼内垫上滤纸，定时观察大鼠排便情况，如有稀便污迹沾染滤纸则需更换滤纸，并及时记录滤纸的污迹面积。持续观察5h后，统计大鼠排稀便的数量及腹泻情况，再根据公式计算每只大鼠的腹泻指数[8]。

腹泻指数=稀便率(每只大鼠的稀便数/总便数)×稀便级(每只大鼠的稀便级数总和/稀便数)。

稀便级数分级[4]：以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小定级，分为4级：1级为污染直径<1 cm，2级污染直径1.0～1.9 cm，3级污染直径2～3 cm，4级污染直径>3 cm。统计每个大鼠排便的总数，再统计大鼠排稀便的总数，并逐一测定每堆稀便的级数，然后参照公式算出腹泻率、稀便级以及腹泻指数。测量污染直径时，如果粪便形状大致为圆形，则可以直接量直径；若粪便形状为椭圆形或较不规则时，则测量其最长距离和近似圆的直径，并将二者相加除以2，即为最后的直径。

Bristol评分：参照Bristol分型积分[9]，对大鼠的粪便形态逐一进行评分，统计后取积分的平均值。

1.5.3 内脏敏感性评价 在造模前、造模后及干预后，先将大鼠禁食12 h，将所有大鼠逐个放入小动物呼吸麻醉诱导盒内，使其吸入异氟烷麻醉。待其麻醉后将带有球囊的8FR导尿管插入大鼠肛门内，导尿管插入深度为4.5 cm，随后用胶带将其缠在大鼠尾巴上固定。将大鼠放入规格为200 mm×80 mm×80 mm的透明固定盒中，并将含有温生理盐水的2 mL注射器接入导尿管尾部，待大鼠完全清醒后尽快检测大鼠的内脏敏感性。测量结直肠扩张时，缓慢向球囊内注温生理盐水，使球囊内的压力逐渐增高，记录大鼠出现腹壁收缩反应及腹部、臀部抬高并抬离地面时的容量阈值，需重复3次该操作，并取平均值。

1.5.4 荧光定量 PCR法检测结肠组织PAR-2 mRNA的表达：称取大鼠自肛门上6 cm处的结肠组织50～100 mg，剪碎，放入低温研磨机中进行组织研磨，用AG RNAex Pro RNA提取试剂盒提取结肠组织总RNA。用Evo M-MLV反转录试剂盒反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒提供的反应体系进行PCR扩增。PCR反应体系：各基因对应上下游引物(引物序列见表1)各0.4 μL，2×SYBR® Green Pro Taq HS Premix 10 μL，cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，最后加RNase free water到20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30s，40个循环。以GAPDH为内参，运用2-△△Ct公式计算目标mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.5.5 Western blot法检测结肠组织 PAR-2蛋白相对表达量：称取大鼠自肛门上6 cm处的结肠组织50～100 mg，加入适量的RIPA裂解液和适量的PMSF溶液，并放入研磨机内进行研磨、裂解。4℃、14000 rpm离心15 min，取上清液，得到总蛋白溶液。利用NANODROP RNA质量检测仪进行总蛋白浓度测定，经过电泳，通过转膜装置恒流转膜，按照转膜海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜(经甲醇活化后)-滤纸-转膜海绵的顺序，持续转膜45 min。转膜结束后，TBST溶液中漂洗1 min，后再放入QuickBlock® Western封闭液内进行约30 min的封闭处理。加入经抗体稀释液稀释的一抗(PAR-2抗体(兔单克隆抗体)按1∶10000稀释，TRPV1抗体(兔多克隆抗体)按1∶1000稀释，GAPDH抗体按1∶1000稀释)，4 ℃缓慢摇动孵育过夜后，用TBST溶液漂洗3遍，加入1∶20000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG)溶液中室温孵育1 h，结束后用TBST溶液漂洗5遍，加入发光试剂盒中A液与B液，将膜放入化学发光成像仪内进行显影。显现结束后得到的条带用分析软件进行灰度值测定。以GAPDH为内参蛋白，目的蛋白与GAPDH的比值为其相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 造模前，各组大鼠精神状态良好，活泼好动，皮毛白净顺滑光泽，眼角口鼻干净，耳廓呈淡粉色，大便干稀适中。造模结束后，与对照组相比，模型组和模型电针组的大鼠日常处于易激惹状态，弓身竖毛，躲避、畏惧，对周围动静十分警惕，进食量相对减少，毛色偏黄，较为粗糙无光泽，肛周及尾部可见明显污秽附着。对各组大鼠在造模与电针干预前后体重值进行比较，如表2所示，造模前各组体重比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；造模后，与对照组相比，对照电针组大鼠体重有所降低，差异不明显，模型组与模型电针组的大鼠体重都明显降低(P<0.01)；电针干预后，与对照组相比，对照电针组大鼠体重有所降低，差异不明显；与模型组相比，模型电针组大鼠的体重明显高于模型组(P<0.01)。

表2 各组大鼠体重值比较

2.2 各组大鼠的腹泻指数与大便Bristol评分比较 如表3所示，与对照组相比，模型组大鼠的腹泻指数与Bristol评分明显高于对照组(P<0.01)，而对照电针组大鼠的腹泻指数、Bristol评分与对照组相比未见有统计学差异；与模型组比较，模型电针组大鼠的腹泻指数、Bristol评分明显低于模型组(P<0.01)。

表3 各组大鼠大便的Bristol评分和腹泻指数

2.3 各组大鼠的内脏敏感性评价比较 直结肠扩张(colorectal distension，CRD)容量阈值包括腹部收缩、腹部抬高、臀部抬高的容量阈值，各组大鼠CRD容量阈值比较结果见表4。与对照组相比，对照电针组的腹部收缩、腹部抬高、臀部抬高的容量阈值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组大鼠腹部收缩和腹部抬高的容量阈值明显降低(P<0.01)，模型组大鼠的臀部抬高阈值低于对照组(P<0.05)；与模型组相比，电针组大鼠出现腹部收缩和腹部抬高的容量阈值明显升高(P<0.05)。

表4 容量阈值

2.4 各组大鼠的腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)评分结果 如表5所示，与对照组相比，模型组大鼠在1 mL容量时的评分明显高于对照组(P<0.01)、在1.5 mL容量时的评分也高于对照组(P<0.05)；与模型组比较，模型电针组的评分呈现降低趋势，电针组大鼠在1 mL容量时的评分低于模型组(P<0.05)、在1.5 mL容量时的评分也明显低于模型组(P<0.01)。

表5 腹壁撤反射评分

2.5 各组大鼠结肠中PAR-2的mRNA及蛋白相对表达量比较 如表6和图1所示，与对照组相比，模型组大鼠PAR-2的mRNA及蛋白的相对表达量明显增多(P<0.01)；与模型组相比，模型电针组大鼠的PAR-2的mRNA及蛋白的相对表达量均有所降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表6 各组大鼠PAR-2的mRNA及蛋白相对表达量比较

图1 各组大鼠PAR-2蛋白Western blot电泳图

3 讨论

IBS是一种与多因素相关的疾病，具有复杂的潜在发病机制，至今尚未有完整、确切的解释。目前，内脏高敏感是对该病的发病机制阐述中较普遍的认识之一。中医学将IBS-D归为“泄泻”“腹痛”的范畴，肝失疏泄、脾胃虚弱是主要病机[10]。足三里属胃经合穴、胃下合穴，可补中益气，通过相关的数据分析结果显示，临床上针刺治疗IBS-D时，足三里穴是使用频率较高的穴位之一[11]。研究表明，电针足三里穴可明显纠正偏于正常生理状态的胃肠功能抑制状态，对胃肠功能起促进作用[12]。本实验结果显示，电针组大鼠的腹泻指数、Bristol评分明显降低；CRD容量阈值明显升高；AWR评分明显降低，表明电针足三里能降低IBS-D模型大鼠的内脏敏感，并改善其腹泻情况。

随着IBS生理病理研究的不断深入，近年来，国内外研究发现PAR-2介导的信号通路在其发病机制中起到重要影响。PAR-2存在于体内多种组织或器官中，其在胃肠道内分布较为广泛，同时胃肠道内含有多种能激活PAR-2的蛋白酶，被激活后的PAR-2会产生多种能影响消化系统功能的生物学效应，且被认为与多种消化系统疾病有密切的联系。已有的研究[13-17]发现：PAR-2在控制人结肠黏膜通透性中起着重要作用，PAR-2活性的增加是IBS直肠黏膜通透性增加的原因之一；IBS-D患者的粪便中的蛋白酶活性较高，推断PAR-2与IBS-D的发病存在一定的联系，并且还发现当外源性的PAR-2激动剂在大鼠体内发生作用时，内脏敏感的阈值会呈现降低的趋势；IBS患者肠组织中PAR-2的表达量较健康人升高；PAR-2受体信号传导可能是IBS-D患者中伤害感受器持续过度兴奋的基础，IBS小鼠模型中PAR-2的激活能增加肠道通透性，并且导致免疫激活和内脏超敏反应。本实验结果显示，模型组大鼠PAR-2的mRNA及蛋白的相对表达量明显增多，而电针可以降低其表达。由此推测，IBS-D的发病机制可能与PAR-2存在密切联系，电针足三里穴改善IBS-D模型大鼠的腹泻及内脏高敏感可能与PAR-2的表达水平降低有关。而PAR-2及其相关的信号通路如何在电针过程中发挥作用，还有待于今后的进一步研究。