枸杞多糖对人视网膜色素上皮细胞光损伤保护的实验研究*

李 娟，高园园，黄 洁，杨晓旭，赵芳芳，俞 洋，5△

(1.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004；3.宁夏回族自治区中西医结合医院，宁夏 银川 750021；4.银川国龙医院，宁夏 银川 750004；5.宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004)

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是引起西方国家50岁以上老年人低视力和盲的首要原因[1]。在我国随着生活水平的提高，AMD发病率也呈逐年上升趋势。RPE光损伤可能是视网膜光损伤的关键，AMD与RPE细胞光损伤密切相关[2]。前期研究显示：枸杞子对RPE细胞具有一定的保护作用[3-4]，枸杞子作为中国传统的药食同源食物，其富含枸杞多糖、多种氨基酸、甜菜碱、微量元素、维生素、生物碱、脂肪酸等化学成分，其中，枸杞多糖(LBP)作为枸杞子主要的有效成分，由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等单糖成分组成，具有诸多重要的生理功能。目前受提取工艺的影响，导致成品枸杞多糖的纯度不一，为研究此种差异对视网膜光损伤保护的影响，本实验选取纯度为50%、65%的LBP，以人RPE为研究对象，观察LBP对光诱导人RPE细胞凋亡的影响，探讨不同纯度枸杞多糖对人RPE细胞光损伤保护的作用机制，提高枸杞多糖在临床应用的利用率。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)，购于BNCC。

1.2 主要试剂与药物 50%、65%纯度LBP(北京索莱宝生物有限公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM/F12(美国 HyClone 公司)；青霉素-链霉素混合液、胰蛋白酶(北京索莱宝生物科技有限公司)；磷酸盐缓冲液(美国HyClone 公司)；CCK8 检测试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；AnnexinV-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量试剂盒、全蛋白提取试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；Bcl2 Antibody(美国Proteintech公司，货号12789-1-AP)；Bax Antibody(美国Proteintech公司，货号50599-2-Ig)；Caspase-3 Antibody(美国CST公司，货号9662S)；Caspase-9 Antibody(北京博奥森公司，货号bs-0050R)。

1.3 主要仪器 Multiskan 酶标仪(Thermo 公司)；FACSAriaⅡ型流式细胞检测仪(美国 BD 公司)；TES-1332A 数位式照度计(台北泰仕电子工业)。

1.4 实验方法

1.4.1 配制安全浓度LBP溶液 分别称量(50%，65%)LBP粉末各5 mg，用5 mL DMEM/F12完全培养基溶解，涡旋振荡制成终浓度为1 mg/mL LBP原液；取上述原液用0.22 um无菌过滤器灭菌过滤后，用DMEM/F12完全培养基稀释10倍，制成终浓度为0.1 mg/mL LBP溶液。

1.4.2 细胞培养 配制含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素的DMEM/F12完全培养基。将ARPE-19置于 5%CO2、37°C的培养箱中培养，约每2 d换液1次，待倒置显微镜下见细胞铺满瓶壁约80%～90%，用含EDTA胰蛋白酶消化液消化细胞，于显微镜下观察，当细胞变成小圆点并浮起时，立即用完全培养基终止，以1∶3比例传代，取2～4代细胞用于实验。

1.4.3 构建人RPE细胞光损伤模型 选2～4代人 ARPE-19 细胞培养于6孔板，将自制三基色LED冷光灯置于培养箱内顶端，采取直落式照射。根据预实验结果，测定光照强度和光照时间，使被照细胞同一水平的光照强度为(16500±500)Lux，用上述光照器照射细胞24 h。培养箱内温度变化控制在 36.5～37.5 ℃之间，排除温度升高引起细胞光热损伤的可能，正常组用锡纸包裹，其他各组细胞均在相同培养箱内培养。

1.4.4 实验分组 正常人RPE细胞组(正常组)、正常人RPE细胞+光照射组(模型组)、正常人RPE细胞+光照+50%枸杞多糖组(低纯度组)、正常人RPE细胞+光照+65%枸杞多糖组(高纯度组)，于光照24h给予指标检测。

1.4.5 CCK8法检测细胞存活率 选取生长状况良好的细胞用胰酶消化后，接种于96孔板(密度约5×103个/孔)。用无血清DMEM/F12于培养箱中孵育过夜以同步化细胞。各组于光照结束后终止培养，每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育 2.5 h。酶标仪检测 450 nm 处各孔的OD值并计算细胞存活率。

1.4.6 流式细胞仪测定细胞凋亡率 各组细胞于光照处理结束后，收集旧培养液，用温 PBS 洗涤 2 遍，胰酶消化并收集细胞于离心管中，用冷 PBS 洗涤3遍，用 400μL AnnexinⅤ结合液悬浮细胞，再加入 5 μL FITC 避光孵育15 min，上机前 5 min 避光加 10 μL PI，在1 h内完成流式细胞仪检测。

1.4.7 Western blot 法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平 用蛋白裂解液提取各组细胞蛋白，利用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白定量检测，以50 μg蛋白/泳道上样，经SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜，加入一抗，4℃封闭过夜，TBST洗涤10min3次，加入HRP标记的二抗，暗室中加发光液并进行曝光。采用Image-J软件对蛋白条带进行灰度值分析。

2 结果

2.1 枸杞多糖对光诱导ARPE-19 细胞损伤的影响 与正常组比较，模型组细胞存活率显著降低(P<0.01)；与模型组比较，枸杞多糖(50%、65%)干预组细胞存活率显著升高(P<0.01)；与50%枸杞多糖组比较，65%枸杞多糖组细胞存活率显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 枸杞多糖对光诱导 ARPE-19细胞存活率的影响

2.2 枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞凋亡的影响 与正常组比较，模型组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与模型组比较，枸杞多糖高、低纯度组细胞凋亡率明显呈下降趋势(P<0.01)；与50%枸杞多糖组比较，65%枸杞多糖组细胞凋亡率呈下降趋势(P<0.05)。见表2、图1。

正常组

模型组

50%枸杞多糖组

65%枸杞多糖组

A.正常组；B.模型组；C.50%枸杞多糖组；D.65%枸杞多糖组

表2 枸杞多糖对光诱导ARPE-19 细胞凋亡率的影响

2.3 枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显降低(P<0.01)；与模型组比较，枸杞多糖各纯度组中Bax 、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达呈下降趋势，Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显上升(P<0.01)；与50%枸杞多糖组比较，65%枸杞多糖组中Bax、 Caspase-3、Caspase-9蛋白表达呈下降趋势，Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值呈上升趋势(P<0.05)。见表3、图2。

A.正常组 B.模型组 C.50%枸杞多糖组 D.65%枸杞多糖组

表3 枸杞多糖对光诱导人RPE细胞Bax、Bcl-2、Bcl-2/bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达的影响

3 讨论

AMD是一种引起视网膜黄斑区光感受器和视网膜色素上皮退行性改变和新生血管生成为特征的年龄相关性疾病，由于视觉的高分辨率及色觉辨别主要依靠于黄斑，因此AMD可以引起严重的视觉障碍甚至永久失明[5]。其主要表现为脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)及黄斑部出血、渗出，导致瘢痕组织生成，破坏中心部视网膜。AMD的发病率高，已成为致盲的重要因素，但可以得到治疗的患者却极其有限，因此对AMD病因病机探讨成为眼科学的研究热点。中医学将AMD归为“视瞻昏渺”、“视物异形”、“暴盲”等范畴，与肝、脾、肾的功能失调有关。现代中医学者认为肝肾阴虚、精血耗伤为本病发病的根本病机，阴亏血少可以致瘀；同时阴亏则火旺，火旺也可煎熬脉络而致瘀；血瘀又可阻碍气机，进而湿蕴成痰。瘀血、痰湿、郁火既是病理产物，又是致病因素。目前中医药在治疗AMD的进程中做出了有益的探索，并取得了一定的临床效果，研究表明枸杞子防治眼病疗效显著，是作为防治AMD的首选药[6]。枸杞子性平，味甘，入肝经、肾经、肺经，中医认为它有补肾、滋阴、益精、养血，养肝，明目等功效。枸杞多糖是枸杞子主要的生物活性成分，现代药理实验表明，枸杞多糖具有免疫调节、抗衰老、防辐射、抗疲劳、保护生殖系统、抗缺氧等多种功效，这与其具有Glycan-O-Ser结构的糖缀合物—枸杞糖肽(LbGP)密切相关[7]。枸杞糖肽(LbGP)是从 枸杞多糖中分离纯化得到一种有免疫活性的糖蛋白，分子量为 88 ku，糖含量为70 %，LbGP中含有天然氨基酸，其中Ser含量最高，后续又分离、纯化得到5个糖缀合物LbGP l一LbGP 5，均具有较强的细胞免疫功能及抗氧化作用[8]。目前对枸杞糖肽功能的研究报道较少：枸杞糖肽能减轻缺氧诱导的心肌细胞钙超载以及对缺氧心肌有明显的保护作用[9]；枸杞糖肽对压力应激导致中枢神经系统的炎症反应具有免疫调节效果[10]；枸杞糖肽可提高rd10小鼠视网膜感光细胞的存活率[11]。枸杞多糖的提取率受提取温度、次数、料液比、时间等因素的影响[12]，王杉杉等[13]采用正交试验优化提取条件，枸杞多糖平均得率58.91%；李玲梅等[14]采用的超声法枸杞多糖提取率为86.98%，随着枸杞多糖提取工艺的更新和提高，枸杞子的资源化利用将会更加广泛。

细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，由多种基因调控的主动的、程序化的死亡过程。近年来大量的实验研究表明，线粒体通路在细胞凋亡中起着关键性作用[15]，在众多的凋亡基因中Bcl-2蛋白家族和Caspase家族是当前最受关注的研讨论点。其中Bcl-2和Bax是一对拮抗基因，Bcl-2是抑制细胞凋亡因子，Bax则属于促凋亡因子，研究发现Bcl-2的过度表达可与Bax形成异源二聚体而抑制细胞凋亡[16]，Bcl-2/Bax比值是决定对细胞凋亡抑制作用的关键因素，随着Bcl-2/Bax比值降低，细胞凋亡率明显升高；反之，细胞存活率显著升高[17]。Caspase-3是Caspase家族目前已知最关键的凋亡执行蛋白酶[18]。Caspase-9是细胞凋亡的标志性蛋白，活化的Caspase-9可激活Caspase-3，而活化后的Caspase-3可特异性的水解细胞内各种底物，从而启动细胞凋亡级联反应，使细胞形成凋亡小体，进而导致细胞凋亡[19]。Bcl-2家族参与线粒体凋亡通路，使线粒体膜损伤，细胞色素CytC释放到胞质，当细胞发生凋亡时，Caspase-3 家族在细胞凋亡机制中与凋亡蛋白酶激活因子-1、Procaspase-9形成凋亡复合体，激活Caspase-9，进一步激活Caspase-3从而启动细胞凋亡[20-21]。

本研究结果显示：提升枸杞多糖的纯度后，其Caspase-3、Caspase-9、bax蛋白的表达水平得到了明显抑制，而Bcl-2/Bax比值、Bcl-2的蛋白水平升高，这些结果提示枸杞子对RPE细胞的保护作用可能与线粒体介导凋亡信号通路有密切的联系。枸杞多糖纯度的提升可降低RPE细胞凋亡率，高、低纯度组的比较，表明其保护作用具有一定的差异性[22]，随着其纯度的升高，枸杞多糖相对分子含量就越高，使得药物疗效进一步提高。

综上所述，LBP对光诱导的ARPE-19 细胞损伤具有一定的保护作用，采用提升枸杞多糖纯度的方法，有助于降低细胞凋亡率，提升保护效果，由于本实验条件有限，未能选用更高纯度的枸杞多糖，因此对其保护作用的差异性需待进一步研究证实。