云芝糖肽水提醇沉提取工艺

□ 梁晓婷 广东岭南职业技术学院

云芝糖肽水提醇沉提取工艺

□ 梁晓婷 广东岭南职业技术学院

避免了有毒溶剂使用，本文建立了水提醇沉法提取纯化云芝糖肽的技术方法，以期为云芝糖肽无公害生产提供参考。

云芝糖肽；水提醇沉；提取工艺

云芝糖肽系从云芝或培养的菌丝中提取纯化的结合蛋白多糖，是良好的生物效应调节剂，对迁延性肝炎、慢性肝炎有良好的疗效，能抑制癌细胞的增生，属于国家II类新药。目前，云芝糖肽大多是采用水提醇沉的方式提取，但使用到氯仿和正丁醇等有毒有机溶剂。为了解决这个缺点和不足，本研究采用热水浸提，无水乙醇沉淀，并优化该提取工艺。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

洁净工作台、分析天平、电热恒温培养箱、分光光度计和高速冷冻离心机。经优选LN-CV0707云芝菌株液体发酵菌丝体[1]。牛血清白蛋白、福林-酚试剂、无水乙醇均为分析纯。

1.2 云芝糖肽水提醇沉提取

准确称取1 g（精度至0.1 mg）冻干的菌丝体粉末，加入蒸馏水50 mL，按一定温度、时间、料水比，置恒温水浴锅中提取2次，然后9 000 r/ min离心20 min，上清液转入旋转蒸发仪中浓缩定容至2 mL，加入6 mL无水乙醇，混匀后4 ℃过夜醇沉后9 000 r/min离心10 min，得到的沉淀真空干燥，即得云芝糖肽。云芝糖肽提取率（%）=云芝糖肽质量/菌粉质量×100%。

1.3 云芝糖肽中肽含量的测定

取0.25 mg/mL牛血清白蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL分别置于具塞试管中，加水定容至1.0 mL，加5.0 mL福林-酚试剂甲溶液。摇匀后放置5 min，加0.5 mL福林-试剂乙溶液，混匀后放置20 min，在500 nm波长处测定其吸收度，并建立回归方程。

2 结果与讨论

2.1 不同破碎方式对云芝糖肽提取率的影响

考察了高压均质和匀浆机匀浆两种破碎方式对菌丝体内云芝糖肽提取率的影响。试验结果表明：高压均质法破碎提取的云芝糖肽提取率（62.3 mg/g）较高，比匀浆机匀浆提取率高（48.7 mg/g）。从提取率大小考虑，应选择高压均质法，但由于在小试阶段的发酵液较少，匀浆机匀浆法成本低。因此，选择匀浆机匀浆作为小试阶段云芝糖肽水提醇沉提取方式。

2.2 提取温度对云芝糖肽提取率的影响

考察了50、60、70、80、90 ℃和100 ℃等不同提取温度对云芝糖肽提取率的影响（图1）。从图1中可知，随着提取温度的升高，云芝糖肽提取率逐渐升高；当温度为40℃时，云芝糖肽提取率仅约为80 ℃的一半；当温度升至80 ℃以上时，云芝糖肽提取率下降，而且趋于平缓。考虑温度过高可引起变性等可能性，采用提取温度80 ℃为宜。

图1 提取温度对云芝糖肽提取率的影响图

2.3 提取时间对云芝糖肽提取率的影响

考察了不同提取时间对云芝糖肽提取效果的影响。试验结果表明：提取时间对云芝糖肽提取效果具有显著的影响，当提取时间在1～2 h，云芝糖肽提取率随着提取时间的增加而增大，当提取时间为2 h时，提取率最大，约为48.3 mg/g；当继续增大时，云芝糖肽提取率却呈逐渐下降趋势；当提取时间为5 h时，提取率呈逐渐稳定趋势。为了获得较高的提取率，并且提高提取效率，本研究选择提取时间为2 h。

2.4 料水比对云芝糖肽提取率的影响

考察了提取云芝糖肽的过程中，不同料水比对云芝糖肽提取效果的影响。试验结果表明：当料水比从1︰3递增至1︰6时，云芝糖肽提取率随着料水比的增加而增大；当料水比为1︰6时，提取率最高，为48.6 mg/g；当料水比继续增大时，云芝糖肽提取率却呈逐渐下降趋势。为了获得较高的提取率，并且降低浓缩工艺，本研究选择料水比为1︰6。

2.5 提取次数对云芝糖肽提取率的影响

考察了提取次数对云芝糖肽提取率的影响。试验结果表明：当提取次数为1次时，提取率约占总量的86.0%；当提取次数为2次时，提取率约占总量的96.7%；当提取次数为3次时，提取率约占总量的98.6%。继续增加提取次数时，会消耗能源和成本，并增加后续工艺难度，故选择提取次数为2次。

3 结论

本文建立了水提醇沉提取纯化云芝糖肽的方法，研究发现：高压均质法破碎云芝菌丝体比匀浆法处理效果好；水提醇沉提取工艺最佳条件为：料水比1︰6，提取温度80 ℃，提取时间2 h，提取次数2次。

[1]李岩,周艺,杨凤琼,等.一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺：CN 104262503A[P].2015-01-07.