昆虫体内微生物多样性的影响因素研究进展

魏晓莹， 郭晨亮， 褚 栋

青岛农业大学植物医学学院，山东省植物病虫害综合防控重点实验室，山东 青岛266109

昆虫是生物界中种类最丰富、数量最大的类群，对农业生产和人类健康具有重大影响。 昆虫体内微生物通过直接的方式影响宿主的生物学(Crotti et al.，2012)。 微生物不仅能为宿主昆虫提供营养物质、消化食物、解毒(Mason et al.，2014； Mattila et al.，2012； Warnecke et al.，2007)及提高免疫活性(Engel ＆ Moran，2013)等功能外，还影响宿主的生殖方式(Serbus et al.，2008)、适合度(褚栋等，2005；Guo et al.，2017； Skaljac et al.，2018)、运动行为(Schretter et al.，2018)及抗药性(夏晓峰，2014；Cheng et al.，2017； Guo et al.，2017； Xia et al.，2013，2018)。 因此，体内微生物多样性的研究对于了解宿主昆虫的生物学具有重要意义。

许多微生物很难被传统手段分离培养，因而对微生物多样性的研究造成很大局限(Vaughan et al.，2000)，且环境样品中只有1%左右可培养微生物(Amann et al.，1995)。 目前，针对昆虫体内微生物多样性的检测方法除了传统的鉴定方法(刘玉升等，2007)外，分子生物学方法已广泛应用。 向候君等(2018)已对昆虫内共生菌的各种鉴定方法进行了详细论述，本文不再对此进行介绍。 本文在基于昆虫体内微生物多样性概况的基础上重点介绍影响体内微生物多样性的各种因素。

1 昆虫体内微生物多样性分析概况

目前，昆虫体内微生物多样性的研究多以肠道微生物多样性的研究为主，主要集中于鞘翅目、鳞翅目、双翅目、半翅目、膜翅目、脉翅目和直翅目等昆虫的肠道微生物。

1.1 优势菌门

当前研究表明，昆虫体内微生物的优势菌门以变形菌门或/和厚壁菌门为主。 例如，鞘翅目的天牛Saperda vestita Say(Schloss et al.，2006)，鳞翅目的茶尺蠖Ectropis obliqua Prout (靳亮等，2013)和稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis (Guenée)(刘小改等，2016)，双翅目的地中海实蝇Ceratitis capitata Wiedemann(Behar et al.，2008)、沙蝇Lutzomyia longipalpis (Lutz ＆ Neiva)(Sant′Anna et al.，2012)、柑橘大实蝇Bactrocera minax (Enderlein)(Wang et al.，2014) 和 泽 兰 实 蝇Procecidochares utilis Stone(张某等，2016)，半翅目的豌豆蚜Acythosiphon pisum (Harris)、黑豆蚜Aphis fabae Scopoli(Haynes et al.，2003)和点蜂缘蝽象Riptortus clavatus Thunberg(Kikuchi et al.，2007)，直翅目的沙漠蝗Schistocerca gregaria (Forskal)(Dillon ＆ Charnley，2002)等昆虫的肠道优势菌门仅为变形菌门。 对半翅目的烟粉虱Bemisia tabaci Gennadius 隐种MEAM1 与MED(Lv et al.，2018； Su et al.，2016)、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley(王震杰，2014)、小贯小绿叶蝉Empoasca onukii Matsuda(毛迎新等，2018)和脉翅目的中华通草蛉Chrysoperla sinica (Tjeder)(赵辉等，2017)等成虫的整体分析，发现这些昆虫体内的优势菌门也仅为变形菌门。 此外，鞘翅目的五月鳃金龟Melolontha melolontha (L.) (Egert et al.，2005)，鳞翅目的豆天蛾Clanis bilineata tsingtauica Mell(吕飞和刘玉升，2009)等昆虫的肠道优势菌门仅为厚壁菌门。 然而，鞘翅目的暗黑鳃金龟Holotrichia parallela Motschulsky(Huang ＆ Zhang，2013)、膜翅目的中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius(张义强，2013)、鳞翅目的舞毒蛾Lymantria dispar (L.)(Broderick et al.，2004)、棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)(Xiang et al.，2006)、小菜蛾Plutella xylostella L.(夏晓峰，2014)、贡嘎蝠蛾Hepialus gonggaensis (Fu et Huang)(刘莉等，2008)、栎黄掌舟蛾Phalera assimilis (Bremer et Grey)(文竹等，2015)、马铃薯块茎蛾Phthorimaea operculella(Zeller)(郑亚强等，2017)和美国白蛾Hyphantria cunea Drury(魏丹峰等，2017)以及双翅目的11 种果蝇Drosophila spp.(Wong et al.，2013)的肠道优势菌都以变形菌门和厚壁菌门为主。

一些昆虫肠道优势菌门除了变形菌门或/和厚壁菌门外，还有其他优势菌门，如放线菌门或/和拟杆菌门。 例如，鳞翅目的稻纵卷叶螟(刘小改等，2016)和棉铃虫(Ranjith et al.，2016)的肠道优势菌门除变形菌门或/和厚壁菌门外，主要还有放线菌门；双翅目的家蝇Musca domestica L.(Gupta et al.，2012)和南亚实蝇Bactrocera tau (Walker)(骆米娟，2016)、直翅目的蟋蟀Gryllidae(张科等，2017)等昆虫的肠道优势菌门除含有变形菌门和厚壁菌门外，主要还有拟杆菌门；鞘翅目的光肩星天牛Anoplophora glabripennis (Motschulsky)肠道优势菌门除含有变形菌门和厚壁菌门外，还有放线菌门和拟杆菌门(Schloss et al.，2006)。

由上述可知，同一个目的昆虫其体内微生物的优势菌门也有可能不同。 例如：(1)鞘翅目的天牛、五月鳃金龟、暗黑鳃金龟和光肩星天牛，除五月鳃金龟的肠道优势菌门只含有厚壁菌门外，其他3 种昆虫的肠道优势菌门都含有变形菌门，其中暗黑鳃金龟还含有厚壁菌门，光肩星天牛还含有厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门；(2)鳞翅目的豆天蛾、茶尺蠖、稻纵卷叶螟、舞毒蛾、棉铃虫、小菜蛾、贡嘎蝠蛾、栎黄掌舟蛾、马铃薯块茎蛾、美国白蛾、稻纵卷叶螟和棉铃虫，除豆天蛾的肠道优势菌门只含有厚壁菌门外，其他11 种昆虫的肠道优势菌门都含有变形菌门，其中舞毒蛾、棉铃虫、小菜蛾、贡嘎蝠蛾、栎黄掌舟蛾、马铃薯块茎蛾、美国白蛾和棉铃虫这8种昆虫的肠道优势菌门除含有变形菌门外，还含有厚壁菌门，稻纵卷叶螟和棉铃虫还含有放线菌门；(3)双翅目的地中海实蝇、沙蝇、柑橘大实蝇、泽兰实蝇、家蝇和南亚实蝇，上述6 种昆虫的肠道优势菌门除都含有变形菌门外，家蝇和南亚实蝇还含有厚壁菌门和拟杆菌门；(4)直翅目的沙漠蝗和蟋蟀的肠道优势菌门除都含有变形菌门外，蟋蟀还含有厚壁菌门和拟杆菌门。

1.2 优势菌属

同一目的昆虫肠道优势菌门相同时，其肠道优势菌属未必相同。 例如，双翅目昆虫中肠道优势菌门为变形菌门的柑橘大实蝇、地中海实蝇和泽兰实蝇，其中前2 种昆虫的肠道中都含有克雷伯氏菌属Klebsiella 和柠檬酸杆菌属Citrobacter 2 个优势菌属，地中海实蝇还含有泛菌属Pantoea、肠杆菌属Enterobacter 和果胶杆菌属Pectobacterium，而泽兰实蝇与上述2 种昆虫都不同，其肠道优势菌属是沃尔巴克氏体Wolbachia。 又如鳞翅目昆虫肠道优势菌门为厚壁菌门的贡嘎蝠蛾、豆天蛾和舞毒蛾，其中前2 种昆虫的肠道中都含有芽孢杆菌属Bacillus 1个优势菌属，贡嘎蝠蛾还含有肉食杆菌属Carnobacterium，而豆天蛾肠道优势菌属还含有葡萄球菌属Staphylococcus，而舞毒蛾与上述2 种昆虫都不同，其肠道优势菌属则是肠球菌属Enterococcus。

2 影响昆虫体内微生物多样性的因素

研究发现，昆虫体内微生物多样性主要受昆虫性别、发育龄期和种群等方面的影响，另外食物、温度、CO2浓度及辐照等生态因子以及研究手段的局限性等方面也会影响昆虫体内微生物多样性。

2.1 昆虫性别、发育龄期及种群的影响

不同性别的昆虫其体内微生物多样性与丰度存在差异。 例如，家蚕Bombyx mori L.雌雄个体的肠道中除共有的优势菌属外，雄性肠道中特有的优势菌属是青枯菌属Ralatonia、甲基杆菌属Methylobacterium 和葡萄球菌属；而雌性肠道中特有的优势菌属是佩特罗菌属Petrobacter、狭义梭菌属Clostridium sensu stricto；在雄性中有23 个菌属的丰度是雌性的1.5 倍以上，而在雌性中有7 个菌属的丰度是雄性的1.5 倍以上(许刚等，2015)。 中华通草蛉雌雄成虫体内微生物多样性也存在明显差异，雌雄成虫体内除了共有的优势菌属外，雄成虫体内特有的优势菌属为柠檬酸杆菌属、醋酸杆菌属Acetobacter、朝井杆菌属Asaia 和Rosenbergiella，而雌成虫体内特有的优势菌属是Cosenzaea myxofaciens(赵辉等，2017)。

性别相同但颚型不同的昆虫其肠道微生物多样性也存在差异。 例如，3 种颚型(大、中、小)的华美奥锹甲Odontolabis fallaciosa Boileau 的雄成虫肠道微生物中除共有的优势菌门外，中、小颚型宿主中还含有拟杆菌门，而大颚型宿主中的厚壁菌门含量显著高于中、小颚型；3 种颚型的宿主其肠道微生物不仅优势菌门存在差异，其优势菌属也存在差异，除共有的优势菌属外，大、小颚型宿主中还含有Dysgonomonas 属，而中颚型宿主还含有巴尔通氏体属Bartonella(蒋宇等，2018)。

除不同性别的昆虫肠道微生物多样性存在差异外，不同发育龄期的昆虫肠道微生物多样性与比例也存在差异。 如不同龄期的暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物多样性存在差异，其1 龄幼虫的优势菌门拟杆菌门的丰度最高，而第2 和第3 龄幼虫中厚壁菌门的丰度最高(Huang ＆ Zhang，2013)。 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)幼虫肠道中的优势菌属不动杆菌属Acinetobacter，其相对丰度随宿主龄期的变化出现先下降后上升的趋势，在第5 龄时其相对丰度最大；而噬氢菌属Pelomonas 和噬酸菌属Acidovorax 的相对丰度则随着宿主的龄期变化呈现下降的趋势(李文丹等，2018)。 冈比亚按蚊Anopheles gambiae Giles 在幼虫和蛹期时其肠道优势菌门为蓝细菌门Cyanobacteria，而成虫时其肠道优势菌门则为变形菌门和拟杆菌门(Wang et al.，2011)。

发育龄期相同但生存环境不同的昆虫其肠道微生物多样性也存在差异。 如日本弓背蚁Camponotus japonicus Mayr 室内和野外巢群的卵、幼虫和蛹的肠道微生物中除共有优势菌门外，室内巢群的卵中含有泉古菌门Crenarchaeota 的火棒菌属Pyrobaculum 细菌，而野外巢群的卵、幼虫和蛹中含有放线菌门的链霉菌属Streptomyces 和两面神菌属Janibacter 细菌；另外，室内巢群的蚁后中含有厚壁菌门的芽孢杆菌属和魏斯氏菌属Weissella 细菌，而野外巢群的蚁后中含有厚壁菌门Anoxybacillus 属的细菌(朱卓琳，2015)。

不同地理种群的昆虫其体内微生物多样性与比例也存在差异。 如在10 个不同地理种群的暗黑鳃金龟幼虫肠道中厚壁菌门中的瘤胃菌科Ruminococcaceae 和毛螺旋菌科Lachnospiraceae 以及变形菌门中的肠杆菌科Enterobacteriaceae 和脱硫弧菌科Desulfovibrionaceae 的细菌在10 个地理种群中分布和比例存在显著差异(Huang ＆ Zhang，2013)。通过宏基因组测序首次发现不同地理种群的小贯小绿叶蝉成虫体内共生菌的多样性和比例存在差异，其中，赤壁、大悟和英山样本的优势菌属均为盐单胞菌属Halomonas(相对丰度分别为23.8%、27.1%、8.8%)，武汉样本的优势菌属为泛菌属(相对丰度61.2%)，咸安样本的优势菌属则为沃尔巴克氏体属(相对丰度92.6%)(毛迎新等，2018)。

除上述因素影响宿主体内微生物多样性外，不同海拔高度也会对昆虫体内微生物多样性有影响。例如，栖居于不同海拔高度的13 个中华蜜蜂Apis cerana Fab.种群肠道微生物多样性存在差异，其中，高海拔种群的优势菌属为厚壁菌门中的芽孢杆菌属，而平原和沿海种群的优势菌属为变形菌门中的沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属(Sudhagar et al.，2017)。

2.2 食物、温度、CO2 浓度及辐照的影响

研究发现，食物对昆虫体内微生物多样性具有重要影响(Russell et al.，2009)。 舞毒蛾(Broderick et al.，2004)、棉铃虫(Priya et al.，2012； Xiang et al.，2006)、高山象白蚁Nasutitermes takasagoensis(Shiraki)(Miyata et al.，2007)、美国白蛾(魏丹峰等，2017)、蝴蝶Rhopalocera(Kruttika et al.，2017)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster Meigen(Chandler et al.，2011)、拟果蝇Drosophila simulans(Staubach et al.，2013)、家蚕(相辉等，2007； 向芸庆等，2010)以及冈比亚按蚊(Wang et al.，2011)等昆虫中肠道相关细菌群落的变化与食物有关。 例如，家蚕分别用柘叶与桑叶饲养时，其幼虫肠道中除共有的优势菌属外，用桑叶饲养的家蚕肠道中还含有气单胞菌属Aeromonas、柠檬酸杆菌属、短杆菌属Brevibacterium、埃希氏菌属Escherichia 和克雷伯氏菌属5 个优势菌属，而用柘叶饲养的家蚕肠道中仅含有假单胞菌属和土壤杆菌属Agrobacterium 2 个优势菌属(向芸庆等，2010)。 然而，用无桑饲料饲养的家蚕幼虫肠道中的优势菌属为肠球菌属、栖热菌属Thermus 和葡萄球菌属(相辉等，2007)。 以人工饲料为食的美国白蛾幼虫肠道中的优势菌属为希瓦氏菌属Shewanella 和肠球菌属，其中肠球菌属的丰度显著高于以桑树和柳树为食的幼虫，以桑树为食的美国白蛾幼虫肠道中的优势菌属为葡萄球菌属，而以柳树为食的美国白蛾幼虫肠道中的优势菌属则为芽孢杆菌属(魏丹峰等，2017)。

食物除了对咀嚼式口器昆虫体内微生物多样性有影响外，对刺吸式口器的昆虫也有影响。 例如，烟粉虱(MED 隐种与MEAM1 隐种)分别取食棉花与健康番茄后，其体内细菌属存在显著差异；取食相同植物的烟粉虱(MED 隐种与MEAM1 隐种)其体内共生菌相似度较高(Su et al.，2016)。

温度对昆虫体内微生物多样性也有影响。 家蚕经高温(34 ℃)处理72 h 后，其肠道微生物的丰度显著降低，雌蚕肠道微生物中的酸杆菌门Acidobacteria、拟杆菌门、放线菌门、梭杆菌门Fusobacteria 和芽单胞菌门Gemmatimonadetes 的丰度相较于对照组显著降低，而雄蚕肠道微生物中仅酸杆菌门的丰度相较于对照组显著降低(杜贝贝，2017)。

不同CO2浓度对昆虫肠道微生物的丰度也具有影响。 棉铃虫进行3 种不同CO2浓度(380、550和750 μL·L-1)处理，肠杆菌属在3 个处理间的丰度存在较大的差异，而普罗威登斯菌属Providencia在380 μL·L-1CO2浓度下的丰度远高于其他2 个处理下的丰度(刘金萍，2017)。

除上述因素对昆虫体内微生物多样性具有影响外，辐照对体内微生物多样性也有影响。 对瓜实蝇Bactrocera cucurbitae (Coquillett)遗传区性品系的8 日龄蛹进行100 Gy137Cs 辅照后发现，辐照组的成虫肠道微生物多样性和丰度显著低于处理组，拟杆菌门仅在对照组的其中4 个样品中出现(相对丰度比例分别为4%、16%、5.5%和17%)，而在辐照组的所有样品中其相对丰度比例低于1%；优势菌属普罗威登斯菌属在辐照组中的相对丰度比例显著低于对照组(姚明燕等，2017)。

此外，研究表明，植物病毒对媒介昆虫体内微生物无显著影响。 例如，感染番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV)的寄主植物对烟粉虱(MED 隐种、MEAM1 隐种)相关细菌群落几乎没有影响(Su et al.，2016)。

2.3 研究手段的局限性

昆虫DNA 的提取方法、技术手段(夏晓峰，2014)、引物的选择以及数据库(Su et al.，2016)等可能也会影响昆虫体内微生物多样性的分析。

昆虫DNA 的提取方法可能会导致昆虫体内微生物出现差异。 夏晓峰(2014)对小菜蛾肠道进行16S rRNA 基因V6 高变区和宏基因组测序时，分别使用不同试剂盒提取中肠细菌总DNA，宏基因组分析相较于16S rRNA 的研究结果相比，变形菌门的丰度升高，而厚壁菌门的丰度降低。

分子生物学技术的不同手段导致分析结果存在差异。 例如，夏晓峰(2014)基于16S rRNA 和宏基因组分析发现，2 种分析方法虽然都表明小菜蛾幼虫中肠中变形菌门和厚壁菌门是丰度最高的2个门，但是宏基因组分析相较于16S rRNA 分析发现，变形菌门的丰度相对升高，而厚壁菌门的丰度降低。 原因可能是2 种分析方法在功能基因注释上存在差异，也可能是因为16S rRNA V6 高变区的片段较短，在分类上也可能存在一定的误差。

不同的研究手段中，使用的不同引物也可能是重要的影响因素。 16S rRNA 分析方法需要进行一次PCR 扩增，其引物的偏好性可能会导致某些细菌出现不同的丰度(夏晓峰，2014)。 基于16S rRNA V3-V4 高变区，使用341F 和805R 引物对烟粉虱MEAM1 隐种进行PCR 扩增，在其体内没有发现次生共生菌Hamiltonella (Su et al.，2016)；而对烟粉虱MEAM1 隐种使用Ham-F 和Ham-R 引物进行普通PCR 检测时，在其体内却检测到了次生共生菌Hamiltonella (Chiel et al.，2007； Chu et al.，2011)。 其他研究基于16S rRNA V4 高变区，使用515F 和806R 引物对烟粉虱MED 隐种进行PCR 扩增，在其体内也发现了次生共生菌Hamiltonella (Lv et al.，2018)。 这些结果提示，引物的偏好性可能导致某些细菌出现不同的丰度。

3 小结

综上所述，体内微生物多样性除了与昆虫种类相关外，还与昆虫自身因素(如性别、发育龄期以及不同地理种群)、生态因子(食物、温度、CO2浓度及辐照等)密切相关；此外，技术本身的局限性也影响分析结果。 因此，在对昆虫体内微生物多样性研究中要注意上述因素。

当前，体内微生物多样性的研究方兴未艾。 相信今后随着更加深入、全面的研究，越来越多的昆虫体内微生物多样性将会被人类进一步的挖掘和利用，这对于有益昆虫的开发利用或有害昆虫的治理具有重要的指导意义。