京尼平对KGN 细胞株分泌功能影响的研究

王雪娇，田东梅，廖海霞，李亨利，尹欣，朱明辉

(1.成都中医药大学医学与生命科学学院/附属生殖妇幼医院，四川 成都 611137；2.成都西囡妇科医院， 四川 成都 611137)

0 引言

京尼平是中药杜仲分离出的一种重要成分，既往研究表明，其作用有：保肝利胆、抗炎、抗氧化，抗血栓、抗肿瘤以及抗抑郁等作用，同时也可以用于治疗糖尿病、癌症以及中枢神经系统疾病等作用[1-3]。Tao Zuo[4]等研究表明京尼平可以通过有效的抑制大部分白细胞介素(IL-6，IL-8，IL-10，IL-1ß)的产生，从而达到减少KGN 细胞株凋亡以及减轻氧化应激造成的损伤的作用，同时也可减少多囊卵巢综合征患者的炎症损伤。

在妇产科领域，氧化应激对人类的生殖过程有负面影响，随着女性年龄的增加，卵母细胞逐渐衰老加快，其抗氧化的能力也随之下降，易导致卵母细胞减数分裂过程发生异常，如染色体分离障碍，这导致形成非整倍体胚胎，从儿发生反复种植失败及反复流产。目前临床上能使用的抗氧化剂较少，既往大部分研究均在模拟氧化应激状态下探讨京尼平的抗炎及抗氧化作用，在非氧化应激模型下，京尼平是否也有较好的抗炎症因子分泌功能尚不明确，故本实验讨论了在非氧化应激状态下京尼平对KGN 细胞的分泌功能的影响及可能的调节通路，以期为临床使用京尼平提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

KGN细胞株、京尼平 (Cayman)、胎牛血清(gibco)、DMEM/F12 培养基(gibco)、胰酶(gibco)、双抗(碧云天)、DMSO(Sigma)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)、HSD17B2 抗体(affinity)、CYP19A1 抗体(affinity)、CYP17A1 抗体(proteintech)、UCP2 抗体(proteintech)、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(英国abcam--艾博抗(上海)贸易有限公司)；Human IL-1βELISA KIT、Human IL-6 ELISA KIT、Human E ELISA KIT、Human IL-4 ELISA KIT、Human IL-5 ELISA KIT、Human P ELISA KIT(上海茁彩生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 KGN 细胞株的培养

培养液使用10%胎牛血清+1%双抗的DMEM/F-12，将KGN 细胞常规培养在37℃、5%CO2细胞培养箱中。

1.2.2 实验分组及干预方式

分为实验组和空白对照组，实验组分别加入浓度为0.05μmol/L, 0.1μmol/L, 0.2μmol/L, 0.3μmol/L的京尼平干预，对照组为5/1000DMSO。

1.2.3 ELISA 检 测 上 清 液 中IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 含量

根据酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒说明书方法测定各组细胞上清液中的IL-1β、IL-6 和IL-4、IL-5、E2、P 因子含量。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达

复苏后的KGN 细胞被接种到培养皿中，常规培养24 h 后，显微镜下观察细胞密度达到70%~80%，进行分组实验，收集各组细胞获得总蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，每孔以40μg 样品上样进行SDS-PAGE，采用湿法进行Western blot 转膜 (PVDF 膜) 1 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入I 抗 (HSD17B2、CYP19A1、CYP17A1、UCP2 浓度为1 ∶500~1 ∶1 000，β-actin 浓度为1 ∶5 000)，4℃孵育过夜，Ⅱ抗37℃孵育1 h, ECL化学显色，image J 软件分析蛋白表达水平。

1.3 统计学处理

运用SPSS 22.0 统计软件进行分析。数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。在方差齐性检验的基础上行方差分析，并用SNK-q 检验行各组均数间的两两比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.4 结果

1.4.1 添加京尼平对KGN 细胞培养上清液中IL-6，IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 含量的影响

1.4.1.1 与对照组相比，添加京尼平后，随着京尼平浓度的增加，上清液中雌激素、孕激素分泌量逐渐减少，且差异有统计学意义(P＜0.05)，具体如图1。

图1

表1 不同浓度京尼平干预KGN 细胞株后IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 分泌(±s)

表1 不同浓度京尼平干预KGN 细胞株后IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 分泌(±s)

注：Ctrl 组为对照组，0.05 为京尼平0.05mmol/L，0.1 为京尼平0.1mmol/L，0.2 为京尼平0.2mmol/L，0.3 为京尼平0.3mmol/L 。

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1.4.1.2 添加京尼平后，培养基上清液中的IL-6,IL-1β 较对照组相比均无统计学差异(P＞0.05)，IL-4、IL-5 含量随着京尼平浓度的上升，其分泌量逐渐减少，其中IL-4 的分泌量每组均较对照组差异有统计学意义(P＜0.01),IL-5 的分泌量仅高浓度组(京尼平浓度≥0.2mmol/L)差异有统计学意义(P＜0.05)。具体如图2 所示。

图2

1.4.2 京尼平对KGN 细胞HSD17B2、CYP19A1、CYP17A1、UCP2 蛋白水平的影响

不同浓度京尼平(0、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L)加入培养基中，对KGN 细胞株干预24 小时后提取细胞总蛋白，检测CYP17A1、CYP19A1、HSD17B2、UCP2 蛋白表达，结果如下：随着京尼平浓度的增加，CYP17A1 及HSD17B2 的表达量与对照组比较呈逐步上升趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)；CYP19A1 及UCP2 蛋白的表达实验组与对照组相比在京尼平浓度为0.2mmol/L 时表达量最高(P＜0.01)。

2 讨论

哺乳动物卵巢中最大的细胞群是颗粒细胞群，其在卵巢激素的合成、以及卵泡液的产生、甚至是在卵母细胞间的信息交换、卵母细胞的生长发育和成熟等方面都起着极其重要的作用，临床上取卵后收集的颗粒细胞均已黄素化，本身培养极其困难，且不能传代，而KGN 细胞株具有易培养，易传代等好处，且能模拟正常人颗粒细胞的大部分生理活性，比如激素合成、凋亡调节、表达FSHR 等，被认为是研究人颗粒细胞最佳模型[5]，故本实验采用KGN 细胞株进行相关研究。

图3 不浓度京尼平干预KGN 细胞株24h 后CYP17A1、CYP19A1、17β-HSD2、UCP2 蛋白表达

2.1 京尼平对KGN 细胞株分泌雌孕激素功能的影响

本实验结果提示添加京尼平干预KGN 细胞株后，其E2 及P 分泌量的多少与京尼平浓度呈反比。既往较多研究均认为在辅助生殖中添加雌孕激素对患者有较大的益处，陈某的研究显示[6]ART 患者在接受GnRH-ant 方案时，补充E2 可提高胚胎植入率，张某等[7]文献总结提示经口服避孕药和E2 预处理后可改善辅助生殖中促排卵的效果。吕某某等认为[8]促排卵过程中，高水平孕激素的添加能有效抑制LH 峰，且卵子的成熟数量和质量并不会受高水平孕激素影响，因此，认为此种诱导排卵方式或许可以降低卵巢过度刺激综合征的发生率，高孕激素状态下促排卵方案不失为一种辅助生殖的新方案和新选择，对于需要生殖力保存患者有重要意义。笔者认为，目前京尼平对雌孕激素分泌机制影响的研究甚少，故在临床中针对无明显氧化应激的患者，京尼平的疗效还有待进一步研究。

2.2 京尼平对KGN 细胞株分泌雌孕激素相关蛋白的影响

17β-HSDs 是一种氧化还原酶，在雌、孕激素合成中发挥重要作用，在生殖系统中拥有重要调节功能，同时还具有氧化和还原活性，对类固醇激素含量也有一定的影响[9]。17β-HSD2 是17β-HSDs 的一种亚型，主要存在于人体的肝脏、乳腺、以及分泌期子宫内膜、胎盘、肾脏中[10]；活性的17β-HSDs 可被其转化成低活性酮类固醇，17β-HSD2 还可降低E2 和雄激素活性[11,12]。孕激素经可转化成雌激素，而KGN 细胞株不分泌雌激素，本实验中雌激素水平下降后孕激素分泌也随之下降，与17β-HSD 逐步增加结果一致。

CYP17A1 是一种多功能酶，具有裂解酶和羟化酶两种活性，催化生成所有内源性雄激素。在本实验中，随着京尼平浓度的增加，CYP17A1 的蛋白表达量也同步增加，与左涛[13]等研究高浓度京尼 平0.05mmol/L) 促 进17β-HSDs 和CYP17A1 表达增加实验结果较一致。而本实验CYP19A1 的表达量与京尼平浓度无明显相关性，仅提示在较高浓度(0.2mmol/L)时表达量增加，CYP19A1 是激素转化和合成的关键酶之一，睾酮和雄烯二酮转变成雌二醇，以及排卵前卵巢合成类固醇激素的关键酶均是CYP19A1，因此关于雌孕激素的分泌与CYP19A1 的关系可进行进一步探究。

UCP2 能调节线粒体膜电位和能量代谢。主要分布在肝脏、肾脏、免疫细胞、脑、中枢神经系统和脂肪细胞等组织中；线粒体代谢在人卵巢功能中有重要意义，研究发现人卵巢颗粒细胞有UCP2 蛋白的表达[18]，认为UCP2 也可参与调节卵细胞生长、发育及成熟[19]。Ge H[20]等研究表明UCP2 被抑制后卵泡细胞合成孕激素下降。本研究中UCP2 的表达与京尼平的浓度改变呈抛物线型改变，在浓度为0.2mmol/L 时表达量最高，与孕激素的改变无明显相关性，故笔者认为UCP2 的表达是否与孕激素分泌调剂有关还存在争议，可进一步探究。

2.3 京尼平对炎症因子的影响

本实验的结果显示，IL-6，IL-1β 较对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)，但随着京尼平浓度增加，炎症因子IL-4 及IL-5 的浓度逐渐降低，且差异有统计学意义，进一步证明了京尼平的抗炎作用。不同的辅助性T 细胞和细胞因子可以由辅助性T 淋巴细胞分化而来。Th2 可分泌IL-4、IL-5、IL-6 等细胞因子，其中IL-4 具有免疫调节多效性，IL-5 具有促进炎症反应的作用[14]。有研究表明IL-4 能促进B 细胞增殖，抑制Th1 细胞因子的分泌，提高机体免疫耐受能力，对维持妊娠有着重要意义[15,16]。而不良妊娠结局常常与Th1 细胞因子增多(IL-2、IFN-γ)和Th2 细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6)的降低有关[17]。

3 结论

在非炎性状态下，京尼平可以明显降低炎症因子IL-4，IL-5 的分泌，但对IL-6，IL-1β 分泌无明显影响，进一步证实了其抗炎作用。但随着京尼平浓度的增加，对雌孕激素的分泌有一定的抑制作用。