环状RNA 高表达与结直肠癌预后不良相关性的Meta 分析

任旻，邹挺，朱云祥

(1.扬州大学医学院，江苏 扬州 225000；2.扬州大学附属医院，江苏 扬州 225000)

0 引言

近些年来，随着国人生活方式、饮食、环境的多方面的变化，结直肠癌的发病率和致死率在逐年升高[1]。现在已经是除胃癌外最常见的消化道肿瘤，根据研究中国恶性肿瘤相关粗发病率和死亡率，结直肠癌可位于前5 位，且出现年轻化趋势[2]。发病隐匿是早期结直肠癌的发病特点，使很多患者错过了最佳手术期，导致结直肠癌患者的5 年生存率低、预后差[3]。目前证明CEA、CA19-9、CA242 及CA125 等肿瘤标记物与结直肠肿瘤预后相关，但仍有相关局限性[4]。因此需要寻找新的、有意义的、和预后相关更直接的预后肿瘤标记物。

1976 年首次在类病毒中首次发现环状RNA (circRNAs)，但当时只是被认为是实验的错误产物[5]。目前发现circRNA 是一类非编码RNA，该种RNA特点是以共价闭合的环状结构替代5’帽子和3’尾端的多聚腺苷酸尾结构，并且结构稳定，不易被核酸外切酶降解[6]。近年来通过研究发现circRNA 作为分子标记物在许多肿瘤发生、进展及远处转移中发挥重要调控作用[7,8]。且多项研究表明circRNA 的高表达与结直肠癌预后不良有相关性，但缺乏相应循证学证据，本研究通过采用 Meta 分析的方式对现已发表的结直肠癌患者circRNA 的表达水平与患者临床特征及预后关系的研究进行分析。

1 资料与方法

1.1 检索策略

通过计算机检索中国知网(CNKI)、万方数据库、维普数据库以及外文相关数据库：PubMed、Embase、The Cochrane Library、Web of Science。检索时间截止为2021 年10 月。采用主题词和自由词结合的方法作为本次检索策略，中文检索词为：结直肠癌、环状RNA 等。外文检索词为：“RNA, Circular”、circRNAs、“Closed Circular RNA”“CircularRNA”“Circular Intronic RNA”“Colorectal Neoplasms”“Colorectal Tumor”“Neoplasm, Colorectal”“Colorectal Cancer”“Colorectal Carcinoma”等。以PubMed 为例，搜索策略见框1。

框1 PubMed 搜索策略

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准

①经过病理学确诊的结直肠癌；②涉及circRNA 与结直肠癌患者术后总生存率(overall survival OS)的相关性，并且可以通过直接或间接方法提取风险比值(hazardratio HR)和95%可信区间(95%CI)的研究；③预后观察指标采用OS 描述；④文献中包括相关临床病理特征(比如样本数、姓名、性别、临床分期、分化程度、是否发生远处转移等)资料；⑤文献语言为中、英文。

1.2.2 排除标准

①研究目的与结直肠癌患者预后不相关的文章，且取材为非组织、血浆、外周血中circRNA，；②重复发表的文献；③摘要、综述、病例报道、荟萃分析；④结局指标与纳入不同或无法从文中提取结局指标的文献；⑤无法获得全文的文献。

1.3 文献筛选及数据提取

文献筛选及数据提取：两名研究员按照规定流程独立对文献进行筛选并提取相关数据，若过程中的分歧则通过求助第三方解决。资料数据提取内容包括：① 纳入研究的基本信息，包括研究题目、发表年份、第一作者姓名、病例来源地区、患者性别、肿瘤 TNM 分期样本总量、淋巴结浸润情况、circ 名称及表达水平、相应检测方法等；②结局指标：从文中直接提取总生存率，或采用Engauge Digitizer 4.1软件提取数据，通过相关计算间接获得OS 值[9]。

1.4 纳入研究的偏倚风险评价

采用Hayden 等2006 年发表的预后研究质量评价工具，评价纳入研究的偏倚风险[10]。T 通过对研究对象、减员偏倚、预后因素测量、结果测量、混杂因素测量和分析这六个方面进行考量，质量评价的分级标准为：“是”“否”“部分”和“不确定”。

1.5 统计学方法

采 用 Review Manager 5.4 软 件 进 行Meta 分析。采用比值比(OR)和风险比(HR)为效应分析统计量，各效应量均提供其95%CI。其中，根据I2大小评价所纳入文献异质性大小。若I2＜50%，提示研究存在同质性，使用固定效应模型分析；如果 P＜0.05 或者 I2＞50%，提示研究间存在异质性，使用随机效应模型分析。若异质性存在时，可通过亚组分析、Meta 回归分析、敏感性分析等方法探讨该因素是否为分析的异质性来源。采用漏斗图检查方法，检测发表偏倚。P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 文献检索结果

根据既定文献检索方法，初步检索获得文献1506 篇。根据指定纳入及排除标准筛查后，最终纳入9 篇[11-19]进入本次meta 分析，具体筛选过程见图1。

图1 文献筛选过程及结果

2.2 纳入研究基本病理特征

本次研究纳入的9 篇文献，样本量共1194 例，均为病理学确诊的结直肠癌，发表时间为2019-2021 年，样本均来自中国。检测方法均为定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction，qRT-PCR)。结 局 指 标均为总生存率OS。其中两篇文献[11,14]从循环层面测得circRNA 表达量，其余文献[12,13,15-19]均从结直肠癌组织层面测得circRNA 表达量。具体基本特征见表1。

表1 纳入研究的基本特征

2.3 纳入研究质量评价

评价纳入研究的偏倚风险工具：Hayden等[10]2006 年发表的预后研究质量评价。具体评价见表2。

表2 纳入研究的偏倚风险评估结果

2.4 Meta 分析结果

2.4.1 circRNA 表达水平与临床特征的分析

将患者年龄、患者性别、肿瘤大小、肿瘤位置、病理分化程度、肿瘤浸润深度、远处转移和区域淋巴结转移与circRNA 表达水平进行系统性评价。Meta 分析结果提示：与circRNA 低表达的患者相比，circRNA 高表达结直肠癌患者出现远处转移发生可能更高[OR=2.89，95%CI(1.72，4.86)，P 值＜0.0001]，肿 瘤 更 大[OR=2.72，95%CI(1.40，5.28),P 值=0.003]，区域淋巴结浸润发生可能更高[OR=2.87，95%CI(1.41，6.23),P 值=0.004]，三组差异均有统计学意义。而circRNA 表达水平和年龄、性别、肿瘤位置、TNM 分期、肿瘤浸润深度无相关关系，差异无统计学意义。具体见表3。

表3 circRNA 表达水平与临床特征的分析

2.4.2 circRNA 表达水平和结直肠癌患者OS 的Meta 分析

本研究所纳入的9 篇文献，10 种circRNA 表达量以及HR、95%CI 等数据。根据Q 检验和I2结果(I2=0%，P=0.91)，提示各研究之间不存在相关异质性，故采用固定效应模型进行Meta 分析。结果显示circRNA 高表达组患者OS 更短，总体生存情况较差，两组差异有统计学意义[HR=2.23，95%CI(1.87，2.65)，P＜0.00001]。具体见图2。

图2 circRNA 表达水平和结直肠癌患者OS 的Meta 分析

2.4.3 敏感性分析

对于circRNA 表达与结直肠癌患者OS 关系的研究，逐一剔除各项研究后，并未发现HR 有明显的改变，说明敏感性较低，结果较为稳定可信。具体见表4。

表4 circRNA 表达与结直肠癌患者OS 敏感性分析结果

2.4.4 发表偏倚分析

评价发表偏倚：根据纳入研究的9 篇文献中OS 绘制漏斗图，结果显示集中趋势明显，不存在发表偏倚。具体见图3。

图3 circRNA 表达与结直肠癌OS 关系的漏斗图

3 讨论

目前因癌症死亡的第二大原因现在仍是结直肠癌，约占癌症总死亡人数的9.2%，也是全球第三常见的癌症[20]。中晚期的结直肠癌患者给国家的公共卫生带来了极大的挑战。缺乏锻炼、饮酒、肥胖等不良习惯都跟结直肠癌的发病有关[21]。目前根据患者的病理分型、TNM 分期来定制对应的诊疗方案，是综合治疗结直肠癌的基本原则[22]。若能在发现一些基因改变和结直肠癌的病理分型、远处转移、TNM 分期等病理特征相关，那将会大大提升对结直肠癌诊疗方案的完善，并对判断病人的预后情况有很大帮助。基因的改变会导致肿瘤截然不同的特征，因此可以通过研究结直肠癌患者与正常人基因表达的差异，探究基因改变和肿瘤特性改变的联系，这样对未来结直肠癌诊疗和判断预后提供更精准的依据。

目前对circRNA 的研究成为了一个新的热点。这类RNA 的首次发现是在1970 年代的RNA病毒中[5]，后来随着越来越多的研究提示这类RNA 在真核生物中也广泛存在[23]。目前研究发现circRNA 在比如动脉粥样硬化、神经功能紊乱等疾病的发展中也有参与[24,25]。最主要的是随着研究的深入发现circRNA 与许多恶性肿瘤的预后有着明显的关联，比如肝癌[26]、肺癌[27]、乳腺癌[28]等。

LiXiangnan 等[29]发 现circddx17 在 结 直 肠癌组织中明显下调，并且与不良临床病理特征有关，发现抑制circddx17 可促进结直肠癌细胞的增值、迁移、侵袭和抑制凋亡。Jin Y 等[30]发现circ_0000523 可间接调节信号转导 通 路Wnt/β-catenin 信号转导通路，参与结直肠癌的进展。HsiaoKueiYang 等[31]发现circCCDC66 在结直肠癌和息肉患者中表达升高，并且提示与不良有关。由此可见各种类型的circRNA 在结直肠癌中作用机制各异，但是在结直肠癌的发生、发展、转移及预后等方面都扮演者重要的角色。

根据本次meta 分析结果显示，在临床病理特征方面，结直肠癌的大小、远处转移和区域淋巴结浸润与circRNA 的高表达成相关性，且差异具有统计学意义(P＜0.01)。并且circRNA 高表达的结直肠癌患者OS 与circRNA 低表达的结直肠癌的患者更短，并且各研究间无明显差异性，敏感性分析也显示结果稳定，提示circRNA 高表达是结直肠癌不良预后的危险因素。

本研究更精准的关注高表达circRNA 与结直肠癌患者预后的关系，并且对circRNA 与结直肠癌的临床病理特征之间的关系做了相关分析，提示高表达circRNA 可能通过影响结直肠癌生长、迁移和对周围组织的浸润等能力造成结直肠癌患者预后不良。

本研究仍然存在局限和不足：(1)纳入的研究相对较少，纳入研究均为回顾性分析，可能存在回忆、测量和报告偏倚的风险；(2) 由于结直肠癌在不同地域的病因、病理学特征和预后相关有较大差异，本次研究纳入的病例全部来自中国，故本次研究的结果无法为其他地区及人种提供更好的参考；(3)纳入本次meta 分析的患者数量相对不多，因此还需要更大规模的研究来验证本次结果；(4)部分纳入文章中无法直接提供HR 和95%CI 数据，需要从生存曲线中自行提取和计算，因此HR 和95%CI 的准确性欠佳。

综上所述，根据分析结果提示高表达circRNA可以作为结直肠癌患者判断预后的重要因素，可以成为评估结直肠癌患者生存结局的辅助指标之一。但受限于纳入研究数量，本研究结果仍需要更多高质量的临床试验验证，为临床实践工作提供更有意义的参考。