静态顶空/气相色谱-质谱联用法测定葡萄蒸馏酒中的高级醇

郭亚芸，史红梅，丁杰，王显苏

（山东省葡萄研究院/山东省酿酒葡萄与葡萄酒技术创新中心，山东济南 250100）

葡萄蒸馏酒是以葡萄为原料，经发酵、蒸馏、勾兑而成的饮料酒[1]。高级醇是葡萄蒸馏酒中主要风味物质之一，其含量极大地影响着蒸馏酒的品质及安全性。高级醇，又称杂醇油，一般指具有3个及以上碳原子的一元醇[2]，是酵母在酒精发酵过程中产生的代谢产物[3]。高级醇种类和含量对蒸馏酒的香气特征和风味起着决定性作用，适量的高级醇能够使酒体醇甜、丰满[3-4]。然而，高浓度的高级醇使蒸馏酒产生“异味”，饮用之后使人产生头晕、头痛的感觉，也就是通常所说的“上头”。此外，高级醇在人体内的代谢比乙醇缓慢，过量累积也会导致肝损伤[5-6]，对人体健康造成严重危害。葡萄蒸馏酒常见的高级醇有正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇和正戊醇5种。因此，对葡萄蒸馏酒中5种高级醇的精准检测和质量控制显得尤为重要。

《蒸馏酒及配制酒—卫生标准的分析方法》（GB/T 5009.48—2003）中推荐了分光光度法和填充柱气相色谱法作为高级醇的检测方法[7]。但两种方法均有一定的缺陷，分光光度法试验操作繁琐，耗时长，试验中显色不稳定，重现性差，准确度不高[8]；填充柱气相色谱法采用外标定量法，进样技术的高低，直接影响着试验结果的精密度与准确度。因此，本研究采用内标标准曲线法。与外标法相比，该方法不受进样误差制约，试验结果更加准确。

静态顶空法是一种间接分析方法，应用于挥发性、半挥发性物质的分析。与直接进样法相比，不存在仪器和色谱柱被污染的风险，还具有操作简单、易于自动化等优点[9]。本研究采用静态顶空/气相色谱-质谱联用同时测定葡萄蒸馏酒中正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇和正戊醇5种高级醇含量，旨在为葡萄蒸馏酒的产品质量安全提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津GCMS-QP2010 Ultra及工作站（日本岛津），AOC-6000顶空进样器，电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），20 mL顶空瓶（瑞士CTC Analytics AG）。

氯化钠和无水乙醇均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。正丙醇（99.5%）、异丁醇（99.5%）、正丁醇（99.7%）、异戊醇（99%）、正戊（99.5%）和叔戊醇（99.5%）均购自阿拉丁试剂有限公司。1#、2#、3#、4#、5#、6#葡萄蒸馏酒均为本试验室产品，酒精度分别为65%、60%、55%、65%、60% 、55% Vol。

1.2 GC-MS测定条件

GC条件：色谱柱为RTX-WAX毛细管色谱柱（30 m× 0.25 μm×0.25 mm）；载气为高纯氦气；分流进样，分流比为50∶1，进样口温度200 ℃；柱温采用程序升温：35 ℃保持5 min，再以18 ℃·min-1升至100 ℃，最后以25 ℃·min-1升至150 ℃，恒流模式，流量1.0 mL·min-1

MS条件：色谱-质谱接口温度250 ℃，离子源温度200 ℃；电离模式：电子轰击源（EI），轰击能量70 eV。选择离子监测待测物质的保留时间、定量离子和定性离子（表1），以叔戊醇为内标物。

表1 选择离子检测叔戊醇和5种高级醇的保留时间、定量离子和定性离子Table 1 Values of retention time and quantitative and qualitative ions under SIM mode for tert-amyl alcohol and five high alcohols

1.3 混合标准储备液和模拟酒样的配制

样品空白基质：用无水乙醇和超纯水配制体积分数为60%的乙醇溶液，作为样品空白基质。

混合标准储备液：准确称取正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇和正戊醇各1.0000 g于100 mL容量瓶中，用样品空白基质溶解并定容，配成质量浓度为10 g·L-1的混合标准储备液，于4 ℃保存，备用。

模拟酒样：由样品空白基质将混合标准储备液稀释而成。

1.4 顶空气相色谱-质谱法试验过程

取5.0 mL葡萄蒸馏酒样（提前添加无水乙醇或稀释成酒度60%）或模拟酒样于20.0 mL顶空瓶中，加入0.5 g氯化钠，5 µL叔戊醇作为内标物，用带硅橡胶胶垫的具有磁力的瓶盖封闭，放入自动进样器样品盘，顶空进样器设定转速为250 r·min-1，在55 ℃下搅拌10 min，进样1000 µL。

2 结果与分析

2.1 顶空条件优化

2.1.1 顶空平衡温度的优化

在静态顶空进样中，样品的平衡温度将直接影响试验结果。本试验考察了平衡温度分别为40、45、50、55、58 ℃下的目标物峰面积的大小。结果表明，5种高级醇的峰面积随温度升高而增大，55 ℃时达到最大，然后峰面积随温度升高而减小（图1）。平衡温度越高，5种高级醇的蒸气压越高，顶空气体的浓度越高，峰面积越大；另一方面，过高的平衡温度可能造成待测组分在传输管路中的冷凝，导致进样量变少，峰面积减小[10]，因此，最优平衡温度为55 ℃。

图1 顶空平衡温度的优化Figure 1 Optimization of headspace equilibrium temperature

2.1.2 顶空平衡时间的优化

在顶空过程中，平衡时间是影响试验结果的重要因素。静态顶空试验是在恒温平衡状态下，通过测定从样品基质挥发到顶空瓶上方的挥发性物质而实现的。

本研究考察了平衡时间为5、10、15、20、30 min时对目标物峰面积的大小的影响。结果表明：平衡时间为10 min时，5种高级醇的峰面积最大（图2）。因此，适宜的平衡时间为10 min。

图2 顶空平衡时间的优化Figure 2 Optimization of headspace equilibrium time

2.1.3 NaCl添加量的优化

静态顶空法测定挥发性有机物时，样品基体以及电解质的浓度可能影响活度系数，因此，适当增加液体样品的离子强度，产生“盐效应”，可降低5种高级醇在液体样品中的溶解度，从而影响测定灵敏度[11]，增强目标分析物的响应值。通过考察0、0.5、1.0、1.5 g NaCl添加量，来讨论盐效应对目标分析物峰面积大小的影响。结果表明，当添加0.5 g NaCl时，5种高级醇的峰面积最大，为最佳添加量，见图3。

图3 NaCl添加量的优化Figure 3 Optimization of the amount of NaCl

2.2 方法学验证

2.2.1 标准曲线和方法检出限

取混合标准储备液，分别用样品空白基质配制目标分析物浓度为0.08～10 g·L-1的模拟酒样，添加5 µL 叔戊醇。按照1.4的试验方法进行测定，质谱扫描方式为SIM模式，定性离子和定量离子的选择由表1所示，叔戊醇为内标，绘制内标标准曲线，线性方程如表2所示。5种高级醇在0.08～10 g·L-1的浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数（r）在0.9994～0.9999。以3倍信噪比（S/N）计算得到正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇和正戊醇5种高级醇的检出限在0.25～1.27 mg·L-1。

表2 五种高级醇的线性方程、线性范围、线性相关系数和检出限Table 2 Linear equation, inear range, r, limit of detection for five high alcohols

2.2.2 准确度与精密度验证

为考察本研究建立的SH/GC-MS可行性和用于葡萄蒸馏酒中5种高级醇测定时的准确度，对葡萄蒸馏酒进行添加回收试验。取3种自制的葡萄蒸馏酒（1#、2#、3#），在0.1、0.5、1 g·L-1添加水平下进行加标回收率试验，每个水平重复3次。结果表明：5种高级醇的添加回收率在80.0%～87.0%，相对标准偏差（RSD，n＝3）小于10%。该方法有较高的准确度和良好的稳定性，可用于葡萄蒸馏酒中正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇和正戊醇5种高级醇的检测。

表3 葡萄蒸馏酒中5种高级醇的测定(n=3)Table 3 Determination of five high alcohols in distilled wine (n=3)

2.3 实际样品分析

以所建立的SH/GC-MS，对3种葡萄蒸馏酒（4#、5#、6#）中正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇和正戊醇5种高级醇含量进行测定。结果显示，高级醇总含量分别为1.8486、0.9542、2.1500 g·L-1，见表4。在所选择3种葡萄蒸馏酒中，正丁醇、正戊醇均未检测出，说明这3种葡萄蒸馏酒中正丁醇和正戊醇的量低于该方法的检测限。根据国家标准GB 2757—1981《蒸馏酒及配制酒卫生标准》之前对于高级醇（以异丁醇和异戊醇计）含量要小于2 g·L-1的标准（按60%折算），4#、5#和6#样品均符合要求。

表4 实际葡萄蒸馏酒样品的测定Table 4 Determination of actual distilled wine samples g·L-1

3 讨论与结论

在蒸馏酒中高级醇起着举足轻重的作用，若含量过低，酒体不丰满，口感差；但是含量过高会严重影响酒体的协调性，还会对饮用者的身体健康产生潜在的危害，比如宿醉和严重头痛[12-13]。因此，建立准确可靠的高级醇的检测方法显得尤为重要，在蒸馏酒质量安全控制方面发挥的作用重大。

本试验所选毛细管柱与国标中填充柱相比较，虽然填充柱出峰时间快，但分离效果较差[14]；而本研究选择的毛细管柱，在质谱扫描时用SIM方式，完全可以克服上述问题，结果更加准确。目前，有关运用静态顶空气相色谱-质谱法检测葡萄蒸馏酒中高级醇的相关报道不多。莫燕霞等[15]采用毛细管内标法测定白兰地中高级醇含量，方法检出限为2.5 mg·L-1；于洪梅[16]采用固相微萃取与气相色谱联用法分析了啤酒中的5种高级醇，检出限为2～7 mg·L-1；甄会英等用气相色谱外标法测定葡萄酒中的高级醇，回收率为95.18%～102.25%；芦丽等[18]采用静态顶空气相色谱法分析了保健酒中高级醇含量，检出限为1.4～2.0 mg·L-1。

本文建立了静态顶空与气相色谱质谱联用法对蒸馏酒中高级醇进行检测，通过对顶空平衡温度、顶空平衡时间和氯化钠添加量等静态顶空条件的优化选择，建立了操作简单、快速、准确，且不损伤仪器设备的分析方法，用于葡萄蒸馏酒中高级醇的检测。正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇和正戊醇5种高级醇的检出限为0.25～1.27 mg·L-1，加标回收率80.0%～87.0%，相对标准偏差均小于10%，在实际样品分析中具有良好的适用性。