葡萄中微生物细菌研究进展

荆晓姝，苏玲，张倩倩，汤晓宏，张一帆，管雪强

（1. 山东省葡萄研究院/山东省酿酒葡萄与葡萄酒技术创新中心，山东济南 250100；2. 山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 272018）

植物根际、叶际、果实周围以及植物的内部环境，为细菌提供了良好的生态位，形成了不同的微生物群组合。植物相关微生物（表面微生物、根际微生物以及内生菌）通过与植物互作而影响植物的生长[1]。在生长过程中，植物和微生物交互作用，使微生物的群落结构发生变化[2]，进而影响植物的抗性（生物胁迫和非生物胁迫）和次级代谢产物的产量[3]。微生物对植物的促生机制分为直接促生作用和间接促生作用，直接促生作用包括影响植物体内激素含量[4]，改进植物根际营养状况如促进难溶性磷、钾和微量元素的释放、联合固氮等[5-6]，以及刺激植物产生诱导系统抗性[1,7]等；间接促生作用包括产生抑制病原菌以及害虫的抗生素、抗菌蛋白或铁载体等次级代谢产物[8]，降解农药等生物外源性物。

葡萄由于种植年限较长，其生长发育与微生物关系密切。在生长过程中，葡萄大部分内生菌株来源于土壤，并通过根内层向地上部迁移。因此，土壤和根际菌群结构决定葡萄地上部分的菌落，影响着果实的风土环境[9]。此外，植物促生菌能够通过各种途径提高植物抵抗生物胁迫或非生物胁迫能力。葡萄接种促生菌株后，体内植物激素ABA、SA等含量会增加[7,10-11]。植物激素进一步诱导多种防御途径：（1）渗透调节途径：可以调节气孔开度、糖代谢产物或者萜烯类化合物的产量，减少水分流失，增加抗逆性[10,12-14]；（2）活性氧调节途径：通过活性氧信号调节抗氧化防御基因的转录水平，提高抗逆性[10,15-18]。植物通过以上途径增强植物在生物胁迫以及非生物胁迫下的抗逆性。在葡萄生长过程中，病害严重影响葡萄的质量和产量。拮抗微生物是传统而重要的生物防治，通过产生抑制病原菌以及害虫的抗生素、抗菌蛋白或铁载体等次级代谢产物，减少病原菌的伤害，利用拮抗菌株并挖掘其代谢产物，开发微生物源农药是当今新农药研发的重要来源之一。综上所述，研究葡萄相关微生物对于微生物资源开发，以及利用微生物实现葡萄的绿色栽培和果实的品质提升是葡萄产业提质增效的重要路径。

1 葡萄微生物细菌种群结构研究进展

现有研究表明，影响葡萄微生物细菌种群结构的因素有葡萄园风土、树龄、砧木种类、葡萄品种及发育阶段等，其中葡萄园风土是由管理方式、葡萄园位置、土壤质地、气候等综合决定的。

在葡萄园中，土壤、树皮、叶片和果实上的细菌群落大小和结构既有生态系统特异性，又有交互作用。由于生态环境的营养程度不同，细菌丰度以及多样性在不同的生态位中有差异，表现为土壤和树皮中较高，叶片和果实稍低[19]。尤其是果实早期阶段，与土壤和树皮相比较，果实中细菌的丰度和多样性更少。在不同的生态位中，核心微生物菌群放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria） 均有存在，但是数量不同[19]。并且，细菌群落结构也具有相似性：土壤和树皮的群落结构相似，树叶和果实的群落结构相似。土壤中的微生物菌群结构与土壤pH以及质地相关[20]，主要为放线菌门、变形菌门（以β-变形菌门为主）。此外，拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门、梭菌门（Clostridia）、厚壁菌门和酸菌门 （Acidobacteria）的丰度有显著地域差异[19-20]。树皮中主要是放线菌门、梭菌门和多种变形菌门（α-、ε-、γ-变形菌门）。叶片和浆果中主要是变形菌门，且以α-和γ-变形菌门为主[19]。种群结构分析表明，葡萄果实表面的核心微生物菌群结构大致相同[21]。从门的水平来讲，优势菌门为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。从属的水平上来讲，优势菌属为假单胞菌 （Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、芽孢杆菌（Bacillus）、短小杆菌（Curtobacterium）、甲基杆菌（Methylobaxterium）[21-23]，这些属种的细菌占整个细菌总量的1/3[21]。

细菌在不同的生态位中具有种属特异性。在土壤和树皮中，50%的种属是土壤和树皮中特有的，在树叶和葡萄果实中不存在。同样，在果实和叶片中，50%的种属果实和叶片特有，在树干和土壤中不存在[21]。并且，叶片和果实的微生物菌群种属具有丰度差异性。与叶片的菌群相比较，有些菌群在果实中更容易检测到[21]。假单胞菌在叶片和果实中具有绝对优势，是微生物核心群中最丰富的属之一，因此以假单胞菌为例研究菌群的生态位特异性。通过序列比对将假单胞菌分为两类：I类假单胞菌和II类假单胞菌。进一步研究发现，果实中主要是I类假单胞菌，叶片中主要是II类假单胞菌以及少量I类假单胞菌[21]。以上结果说明，细菌在不同的生态位中维持平衡和迁移。

嫁接是葡萄生产中最常见和主要的繁殖方式，因此砧木与葡萄微生物菌落的丰度、多样性以及种群关系密切，嫁接的砧木种类决定了根内层的微生物群，也决定了地上部分的微生物群[9]。

以‘马克贝尔’和‘赤霞珠’作为研究对象，分析葡萄园风土和葡萄品种对土壤微生物群落多样性的影响，发现葡萄园风土对葡萄的微生物组成影响大于葡萄品种[20,24]。但是，在特定的地理位置范围内，葡萄品种在微生物群落中起着重要作用。由于不同葡萄品种的果实在大小、形状以及生长特性上具有差异，微生物的生物多样性以及丰度也不同[24]，因此，可以根据关键细菌和真菌类群的丰度区分葡萄品种。

在相同的葡萄园内，与葡萄品种相比较，树龄对微生物菌群的影响更大[23]。对同一葡萄园内不同树龄的土壤微生物进行分析发现，随着树龄的增加，土壤微生物的群落多样性先逐渐降低，然后再逐渐升高。并且，老龄园的细菌降幅明显高于新龄园[25]。长期种植葡萄后，土壤细菌中变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门（Verrucomicrobia）、纤维杆菌门（Fibrobacteres）的丰度明显增加，芽单胞菌门、酸杆菌门、放线菌门等的丰度显著降低[26]。同样，地上部分葡萄果实和叶片上的细菌也呈现相同的趋势[23,26]。随着树龄的增长，葡萄内生菌中的变形菌门由26%增加至80%，其中44%属于α-变形杆菌，36%属于γ-变形杆菌。而杆菌门（Bacilli）和放线菌门分别由48%和26%降至15%和5%[26]。这些研究均说明树龄对葡萄微生物菌群结构具有重要影响[23,26]。与多数耕作土地相同，土壤微生物中变形菌门和拟杆菌门的丰度增加可能更多的与葡萄园的耕作相关[20,27]。但是，也有研究分析土壤管理方法与微生物菌群结构的关系，发现菌群结构在果实中没有相应的动态变化[28]。

葡萄中微生物群落的演替还受到葡萄发育阶段的影响。在不同的葡萄园中，核心微生物菌群结构与葡萄发育阶段相关，且葡萄发育阶段对微生物多样性的影响大于葡萄园风土对微生物多样性的影响。在发育过程中，菌群的多样性呈下降趋势，但保留核心微生物群，并且核心菌群能够来区分葡萄的发育阶段。例如，链格孢属 （Alternaria）在坐果期、转色早期以及转色晚期积累，但是在成熟收获期减少。鞘氨醇单胞菌在葡萄坐果期、转色早期以及转色晚期丰度都很高，并且在转色早期迅速增长[29]。

综上所述，葡萄园风土、砧木种类、种植年限、品种以及果实发育过程中葡萄表皮微生物群落呈现动态变化，但是始终保留核心微生物菌群。探索微生物菌群的变化，有助于提高葡萄园的管理技术，合理利用葡萄园的生态功能，减少化学杀菌剂或农药的使用，保持葡萄园的生态健康，突出葡萄酒的地域特色[29]。

2 葡萄微生物细菌对非生物胁迫的研究进展

自然界中，植物会受到干旱、低温、重金属、盐碱等不利的非生物环境因素影响。植物应对不同的非生物胁迫时，存在反应的特异性和交叉性。植物体内，活性氧在信号传导过程中发挥着关键作用[30-31]。在非生物胁迫时，活性氧作为信号，可以诱导活性氧清除机制，提高抗氧化防御基因的转录水平或者增强抗氧化物质含量来抵御氧化胁迫。但是，当植物不能有效调节活性氧的产生与清除之间的平衡时，造成活性氧积累，引起氧化胁迫[30,32]。另外，植物在非生物胁迫时还可以通过积累和吸收无机离子或者增加小分子化合物在体内的合成和积累，充当胞质渗透剂，降低水势来协调细胞与外界的渗透平衡，增加细胞的保水能力[33]，来缓解渗透胁迫。植株接种微生物后可以通过活性氧平衡和渗透平衡等生理生化方面的变化来应对非生物胁迫[10,12-14,34]。

2.1 低温胁迫下微生物细菌增强葡萄抗逆性

伯克氏菌PsJN（Burkholderia phytofirmans，PsJN）是最先从洋葱中分离得到的一种常见的根际促生菌。在常温（26 ℃）和低温（4 ℃）下，接种伯克氏菌PsJN均能不同程度的增加根质量和植株生长量[12]。电解质渗透率是检验植物逆境胁迫后细胞膜透性的参数，低温处理后，葡萄叶片的电解质渗透率以及脯氨酸含量明显升高，表明葡萄受到胁迫。但是，接种伯克氏菌PsJN后可以缓解电解质渗透率的升高，增强植株抗逆性[12]。葡萄幼苗接种PsJN后，通过提高淀粉、可溶性糖（甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等）等渗透调节物质的含量，从而缓解葡萄幼苗的低温冷冻胁迫[12-13]。低温胁迫下，葡萄由于活性氧积累导致叶片膜脂过氧化，致使细胞死亡。接种伯克氏菌PsJN后，葡萄可以迅速增加活性氧产量，激活下游信号通路，提高逆境防御基因转录水平[14]。同时，葡萄还可以通过酚类等刺激代谢产物缓解氧化胁迫，来提高葡萄的抗寒性[12-14]。

2.2 重金属胁迫下微生物细菌增强葡萄抗逆性

重金属胁迫方面，接种根际促生菌能够提高葡萄的抗逆性。用耐砷菌株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、滕黄微球菌（Micrococcus luteus）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）接种葡萄，研究重金属污染下根际促生菌对葡萄的影响。在砷处理后，接种微生物的植株中抗坏血酸过氧化物酶（APX）、氧化氢酶（CAT ）、过氧化物酶（POD）多种抗氧化酶的活性能力明显提高，能够快速有效的清除活性氧，缓解重金属引起的氧化胁迫。因此，在砷胁迫处理下，接种促生菌的植株在根质量、植株生物量以及蛋白含量方面明显提高[34]。

2.3 渗透胁迫下微生物细菌增强葡萄抗逆性

渗透胁迫下，将‘马尔贝克’幼苗接种细菌芽孢杆菌Rt4M10和假单孢菌Rt6M10后，葡萄植株高度、根长与叶面积均高于对照组。并且在接种细菌20、30 d，萜类化合物含量逐渐增加。其中，单萜类化合物α蒎烯、异松油烯、桉树醇和橙花醇，倍半萜类化合物α-佛手柑烯、α-金合欢烯和金合欢醇均有所增加，并且假单孢菌Rt6M10对萜类化合物的诱导作用明显高于芽孢杆菌Rt4M10。在接种细菌30 d后，叶片中的ABA含量增加且失水率明显低于对照组，说明细菌可通过诱导萜类等次生代谢产物的生物合成，或者通过提高叶片中ABA的含量来缓解逆境胁迫[10]。

3 葡萄微生物细菌对生物胁迫的影响研究进展

葡萄微生物对生物胁迫主要从两个方面来影响：（1）通过调控微生物菌群中具有拮抗活性的菌株，抑制病原菌，减少病原菌对葡萄的生物胁迫；（2）通过与植物相互作用，刺激植物产生诱导系统抗性，促使植物调节活性氧平衡和渗透平衡等，增强葡萄的抗逆性，缓解生物胁迫对植物的影响。

3.1 生物胁迫下微生物拮抗细菌的筛选

通过研究感病葡萄和健康葡萄微生物的群落结构，分析葡萄微生物抵御生物胁迫的机制，并且从中筛选具有拮抗活性的菌株。葡萄枝干病（Grapevine trunk diseases，GTDs）是一类主要引起葡萄枝干木质部坏死、溃疡和顶梢枯死，严重时导致整株死亡的真菌性病害的总称。目前，国际上已经报道了相关的5种葡萄枝干病害，即葡萄衰枯病（Escadisease complex）、葡萄黑根病（Black foot disease）、葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）、葡萄蔓枯病（Diaporthe dieback）和葡萄顶枯病（Eutypadieback）。研究人员通过分析有枝干病症状和健康葡萄的内生菌群落结构发现，假单胞菌在健康葡萄中的丰度更高（56%或74%），而在感病葡萄中仅占 29%或2%。因此，推测假单胞菌具有生物防治GTD病原体的潜力。进一步验证发现，9株假单胞菌对葡萄溃疡病、3株假单胞菌对顶枯病和2株假单胞菌对葡萄衰枯病病原菌具有拮抗活性[35]。葡萄黄化植原体病是一种世界性的危害性病害，研究人员分析健康、感病以及恢复后的葡萄中微生物菌群结构时发现，与健康葡萄相比较，感病以及恢复后葡萄的微生物多样性降低，且高度相似。甚至有些生防菌株只能在恢复的植株中检测到[36]，表明葡萄可以调控微生物菌群结构，利用生防菌株增强植物的抗逆性[36]。酸腐病也是一种综合性病害，能够造成果穗腐烂，严重影响葡萄果实品质。通过分析酸腐葡萄的微生物菌群结构以及体外腐败试验，鉴定筛选出导致酸腐病的病原菌主要有细菌和真菌葡萄[37]。其中细菌有克罗诺杆菌（Cronobacter）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）和梭状芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis），真菌有葡萄枯萎病菌[38]，并且筛选出具有拮抗活性的芽孢杆菌[38]。

3.2 生物胁迫下微生物细菌抗逆机理

已有研究表明，接种伯克氏菌、假单胞菌等生防菌株可以增强葡萄抵抗灰霉病的能力。与单独接种灰霉病原菌的相比，葡萄在接种促生菌株后，可以迅速产生活性氧信号[39]，激活下游防御基因通路，一方面通过提高糖代谢相关基因的转录水平维持糖代谢平衡提高抗逆性[15]，另一方面通过调控细胞凋亡相关的HSR基因[18]，提高酚类化合物的产量来增强植株抗氧化能力和抗逆性[16-18]。

此外，葡萄可以通过调节活性氧平衡途径提高抗逆性。接种从葡萄根际分离的菌株（Microbacterium imperialRz19M10、Kocuria erythromyxaRt5M10、Terribacillus saccharophilusRt17M10、Bacillus licheniformisRt4M10和Pseudomonas fluorescensRt6M10）后，葡萄叶片中活性氧清除系统中α-蒎烯和橙花醇等萜烯类化合物的含量提高，从而提高叶片抗氧化能力[10]，因此叶片具有更好的光保护特性[40]。

4 未来与展望

随着人们对生活品质的要求，全球对具有多种活性天然产物的浆果以及加工产品的需求量日益增长，对果实品质和栽培方式的提升越来越受到重视。微生物在提升果实品质和绿色栽培中有重要作用，为新型高效绿色农业的发展带来了新机遇。

葡萄作为种植周期较长的植物，研究环境微生物和生长之间的关系具有重要的应用前景。目前高通量测序表明，葡萄园风土、葡萄树龄、砧木种类、品种以及发育阶段影响微生物的群落结构，进而影响葡萄的生长以及次级代谢产物的产量。次级代谢产物对果实品质具有重要的作用[9]，研究表明，益生菌能够提高果实中次级代谢产物的含量[41]。但是，目前在葡萄中的研究结果仅限于微生物可以提高叶片的次级代谢产物[10,16-18]。在葡萄微生物与果实品质的相关性研究方面，微生物如何对果实品质进行调控却少有例证。另外，钾和钙对葡萄果实品质具有重要的作用，微生物可以调控植物对营养元素的吸收和利用[9]，但利用微生物与葡萄离子平衡相关的研究，尚未见报道。

在葡萄生长过程中，植物病害等生物胁迫因素以及干旱、低温、重金属、盐碱等非生物环境因素严重影响葡萄的质量和产量[5]。植物应对不同的胁迫时，存在反应的特异性和交叉性。微生物通过抑菌活性、活性氧平衡、渗透平衡和诱导系统抗性来提高葡萄抗逆性[5]。目前，在抑菌活性实验方面止步于筛选出具有活性的菌株[10,35,38,40]，缺少高效天然产物的相关研究。合成生物学的出现和发展为绿色农业的发展带来了新机遇，因此可以利用合成生物学深入研究活性天然产物的结构以及抑菌机理。通过研究微生物与葡萄的特异性定殖，筛选构建针对葡萄的兼具肥药功能的专用菌株。

因此，充分开发和利用微生物的生物学潜力，为促进葡萄生长和品质提升的绿色栽培管理方式提供理论和技术依托，进一步挖掘与果实品质相关的微生物资源有重要意义。