选择性单胚胎移植策略在冻融胚胎移植中的应用效果分析

陈曼，彭三凤，林虹，李志凌

(汕头大学医学院第一附属医院，汕头 515041)

随着体外受精-胚胎移植(IVF-ET)及其衍生技术的快速发展，胚胎种植率及临床妊娠率显著提高的同时，多胎妊娠也相应增多。由于移植多枚胚胎，IVF-ET妊娠的双胎率远高于自然妊娠，并且剖宫产、低出生体重、早产、妊娠期糖尿病、妊娠期高血压疾病、子痫前期和子痫、难产和产后出血等产科并发症的发生风险亦增加，且随着孕妇年龄增大该增加趋势越明显[1]。IVF-ET治疗的理想结局是获得单胎、足月、健康的胎儿，尽量减少多胎妊娠风险及相关的产科并发症，因此选择性单胚胎移植(eSET)是实现此目标的有效措施。有研究表明，与双胚胎移植(DET)相比，eSET足月单胎活产率更高[2]，而来自DET分娩的单胎发生不良围产结局的可能性亦增加[3]。为了降低ART的多胎率，更好地保障母婴安全，《关于胚胎移植数目的中国专家共识》[4]提出了eSET策略，但是部分生殖中心的多胎率仍高达30%以上。eSET对临床妊娠率的影响是阻碍其大范围推广的原因之一。如何进一步细化eSET策略，在临床妊娠率及多胎率之间维持平衡，是目前大多数生殖中心的重点和难点。本研究回顾性分析了eSET在冻融胚胎移植(FET)中的应用效果，以期为进一步推广、细化eSET的临床应用提供依据。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2020年1月至2021年12月在汕头大学医学院第一附属医院生殖医学科行FET助孕治疗的1 233个周期的临床资料。纳入标准：(1)年龄<40岁；(2)接受IVF或卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕治疗，有冻存胚胎且胚胎成功解冻复苏的患者；(3)囊胚移植均为单囊胚移植(SBT)周期，囊胚级别3BB及以上。排除标准：(1)年龄≥40岁；(2)移植胚胎数≥3枚；(3)序贯移植周期；(4)移植含多核、空泡、滑面内质网(SER)胚胎(含SER胚胎指SER聚集的卵母细胞形成的胚胎)的周期。

将纳入研究对象根据移植次数不同分组：第1次移植为1次组，第2次移植为2次组，≥3次移植为多次组；根据患者年龄不同分为<33岁组、≥33岁组。各组内再根据移植胚胎类型、质量及数量细分为下列亚组：D5单囊胚移植组(SBT-D5组)，D6单囊胚移植组(SBT-D6组)，移植1枚D3优质胚胎组(SET-D3优组)，移植2枚D3优质胚胎组(DET-D3优组)，移植1枚D3优质胚胎+1枚D3非优质胚胎组(DET-D3组)。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COS)及胚胎处理：根据患者基本情况选择不同的COS方案，包括短效长方案、卵泡期长方案、拮抗剂方案和黄体期促排卵方案。根据取卵日男方精液情况进行常规IVF或ICSI，受精卵置于37℃、6%CO2培养箱中培养；取卵后第3天或第5天根据COS方案、卵巢过度刺激综合征(OHSS)发生风险、内膜情况等行胚胎移植或全胚冷冻。常规冷冻2～4枚卵裂期胚胎，优先冷冻优质胚胎，其余胚胎行囊胚培养。所有胚胎均采用玻璃化冷冻法，试剂盒及冷冻载杆购自日本加藤公司，具体操作按照说明书进行。

2.胚胎评价标准：(1)D3优胚标准：D1原核为2PN，D2细胞数为3～5细胞，D3细胞数为7～9细胞，D2发育至D3的细胞增速为3～5个细胞，D3胚胎评级为I级或Ⅱ级。(2)囊胚评级：按照Gardner提出的“囊胚扩张程度-内细胞团-滋养外胚层细胞”的评定模式[5]，进行囊胚期胚胎评分。

3.FET策略：根据患者情况采用自然周期、促排卵周期、激素替代周期或降调后激素替代周期进行内膜准备，冷冻胚胎复苏后培养2 h行FET，并行常规黄体支持。(1)囊胚移植：所有囊胚移植均为单胚胎移植，移植的囊胚级别均为3BB及以上，优先选择D5囊胚，其次为D6囊胚；在囊胚形成时间及级别相同的情况下，优先选择D3为优胚的囊胚进行移植；(2)卵裂期胚胎移植：对没有3BB及以上级别囊胚冻存的患者，选择卵裂期胚胎复苏移植。如年龄<33岁，首次移植优先选择单优胚移植；如首次SET未孕，再次移植酌情予DET；如年龄≥33岁，首次移植予DET。对于子宫因素不宜双胎妊娠者，如疤痕子宫、子宫畸形或矫形手术后、子宫颈机能不全或既往有双胎妊娠及流产、早产等不良孕产史者；存在某些全身状况不适宜双胎妊娠者，例如：存在其他合并症，身高<150 cm，体重<40 kg等；上述情况患者，如存在反复着床失败、高龄、胚胎质量差等明显影响成功率的因素，则在充分知情告知后谨慎进行DET，如双胎妊娠建议减胎。

卵裂期胚胎移植后14 d(囊胚移植后12 d)测定血β-HCG，如β-HCG<50 U/L，停黄体支持药物，监测β-HCG至阴性；如β-HCG≥50 U/L，确定为HCG阳性，继续给予黄体支持；胚胎移植后4～5周行第1次B超检查，记录孕囊数、胎心搏动情况及胚胎着床部位。

4.主要观察指标及判断标准：比较各亚组间患者的平均年龄、不孕年限、转化日内膜厚度、临床妊娠率、胚胎种植率、多胎率及早期流产率。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；胚胎种植率=孕囊数/总移植胚胎数×100%；早期流产率=孕12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%；多胎率=多胎周期数/临床妊娠周期数×100%。

超声检查可见孕囊或病理学检查可见绒毛者为临床妊娠；宫腔内同时有两个或两个以上胎儿为多胎妊娠；发生在妊娠12周以前的流产为早期流产；受精卵在子宫腔以外着床为异位妊娠。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况

本研究共纳入1 233个FET周期，患者平均年龄为(31.16±3.77)岁(21～39岁)，平均不孕年限(3.92±2.48)年(1～14年)，平均移植次数(1.65±1.01)次，转化日内膜厚度为(10.17±2.09)mm，移植胚胎数(1.22±0.42)枚，整体临床妊娠率为60.02%，胚胎着床率为53.45%，多胎率9.59%，流产率11.89%，异位妊娠率1.89%。

二、不同移植次数各组中不同移植方案亚组的一般资料及妊娠结局比较

1.各组患者一般资料比较：1次组中SBT-D5组、SBT-D6组和SET-D3优组的平均年龄显著低于DET-D3优组和DET-D3组(P<0.05)；各亚组间平均不孕年限及转化日内膜厚度无显著性差异(P>0.05)。2次组和多次组中各亚组间平均年龄、不孕年限及转化日内膜厚度均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

2.各组患者妊娠结局比较：1次组中SBT-D5组的临床妊娠率显著高于SBT-D6、SET-D3优、DET-D3优组(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6组的胚胎种植率显著高于SET-D3优、DET-D3优、DET-D3组(P<0.05)，SBT-D6组的早期流产率显著高于SBT-D5和DET-D3优组(P<0.05)，单卵裂胚/囊胚移植组的多胎率显著低于DET-D3优、DET-D3组(P<0.05)；2次组中SET-D3优组的临床妊娠率显著低于SBT-D5、SBT-D6及DET-D3优组(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6组的胚胎种植率显著高于其他3组(P<0.05)，SBT-D6组的早期流产率显著高于SBT-D5组(P<0.05)，单卵裂胚/囊胚移植组的多胎率显著低于DET-D3优、DET-D3组(P<0.05)；多次组中SET-D3优、DET-D3组的临床妊娠率显著低于DET-D3优组(P<0.05)，DET-D3组的胚胎种植率显著低于其他各组(P<0.05)，SBT-D6组的早期流产率显著高于DET-D3优组(P<0.05)，单卵裂胚/囊胚移植组的多胎率显著低于DET-D3优、DET-D3组(P<0.05)(表2)。

表2 不同移植次数各组中不同移植方案亚组的妊娠结局比较(%)

三、不同年龄两组中不同移植方案亚组的一般资料及妊娠结局比较

1.各组间一般资料比较：<33岁组中各亚组间平均年龄、不孕年限及转化日内膜厚度均无显著性差异(P>0.05)。≥33岁组中SET-D3优组的平均年龄显著高于SBT-D5和SBT-D6组(P<0.05)，其余各亚组间不孕年限及转化日内膜厚度均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

2.各组间妊娠结局比较：<33岁组中，SBT-D5组的临床妊娠率显著高于SBT-D6和SET-D3优组(P<0.05)，SBT-D5组的胚胎种植率显著高于其余各组(P<0.05)，SBT-D6组的早期流产率显著高于SBT-D5、DET-D3优、DET-D3组(P<0.05)，单卵裂胚/囊胚移植组的多胎率显著低于DET-D3优、DET-D3组(P<0.05)；≥33岁组中，SET-D3优组的临床妊娠率显著低于SBT-D5、SBT-D6、DET-D3优组(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6组的胚胎种植率显著高于其余3组(P<0.05)，单卵裂胚/囊胚移植组的多胎率显著低于DET-D3优、DET-D3组(P<0.05)(表4)。

表4 不同年龄两组中不同移植方案亚组的妊娠结局比较(%)

讨 论

本研究结果显示，1次组中单胚胎移植组患者的平均年龄均显著低于DET患者(P<0.05)，这与我院对年龄<33岁、首次移植患者优先实行eSET策略有关。另外，本研究≥33岁组中SET-D3优组的平均年龄显著高于SBT-D5和SBT-D6组，这是由于随着患者年龄增加、卵巢储备功能下降，获卵数和胚胎数都相应减少，为了减少囊胚培养失败导致的无胚胎移植风险，我院常规冷冻2～4枚卵裂期胚胎，优先冷冻优质胚胎，剩余胚胎再行囊胚培养；而这可能导致部分高龄患者仅有冻存卵裂期胚胎，因此在进行FET时只能移植卵裂期胚胎。

eSET作为避免多胎妊娠的良好策略，面临最大的问题是临床妊娠率降低，如能进一步优化eSET策略，在临床妊娠率及多胎率之间维持平衡，将有利于eSET的普及推广。本研究纳入的研究对象中，大部分采用单卵裂胚/囊胚移植，整体临床妊娠率为60.02%，且多胎率低于10%。eSET的关键因素在于胚胎质量，选择种植潜力好的胚胎可以缩短达到妊娠时间。目前，囊胚培养、时差监测培养系统(TLM)、胚胎植入前遗传学筛查(PGS)和代谢组学等多种胚胎优选的方法已逐渐应用于临床[6]。但TLM系统价格昂贵，尚无法作为常规技术大规模使用；PGS因进行遗传分析增加了时间及经济成本，且部分胚胎无法培养至囊胚期进行活检、活检可能导致胚胎损害、医源性非整倍体以及结果不准确等可能导致健康胚胎浪费等，影响了其作为常规筛查手段的应用[7]；代谢组学作为一个新兴领域，其应用价值尚需进一步研究探索；只有囊胚培养仅仅通过延长胚胎培养时间进一步优选胚胎，因经济成本低、实用性强而广泛应用。但是，关于卵裂期胚胎或囊胚移植的利弊仍有争议，一项Meta分析显示囊胚较卵裂期胚胎在活产率、继续妊娠率、临床妊娠率、累积妊娠率和流产率等方面并没有明显优势(低质量证据)[8]。与上述研究结果不同，本研究中不同移植次数组和不同年龄组囊胚移植的胚胎种植率显著高于卵裂期胚胎或有增高的趋势。郭晓晓等[9]的研究结果认为囊胚移植的临床妊娠率显著高于卵裂期胚胎移植；Zhu等[10]的研究亦发现单囊胚移植的活产率有高于单卵裂期胚胎移植的趋势。但囊胚移植存在因延长培养时间导致周期取消率升高[11]、增加子代男女性别比[11-12]、增加早产及先天畸形的风险[13]，在临床应用中也需引起重视。

在移植囊胚数目上，本研究中所有囊胚移植均为单囊胚移植。Freeman等[14]认为38岁以下人群采用单囊胚移植可在维持出生率的同时有效降低多胎率，这也为本研究中所有囊胚移植均实行单囊胚移植策略的可行性及有效性提供了佐证。囊胚根据形成时间不同分为D5和D6囊胚，不同发育天数的囊胚对临床结局是否具有不良影响，目前尚无统一观点。Ferreux等[15]发现移植D5囊胚的临床妊娠率及活产率均显著高于移植D6囊胚(P<0.05)。一项Meta分析结果也显示，无论鲜胚或冻胚移植，D5囊胚较D6囊胚移植具有较高的临床妊娠率和活产率[16]。漆倩荣等[17]则认为冻融周期胚胎的发育天数对妊娠结局无显著影响。本研究结果显示，首次移植和年龄在33岁以下的患者移植D5囊胚的临床妊娠率及胚胎种植率均显著高于移植D6囊胚及双优质卵裂期胚胎(P<0.05)，但随着移植次数的增多及年龄的增加，这种优势逐渐减少。分析这可能与年轻患者、首次移植的D5囊胚多为剩余冻存胚胎的最优胚胎，胚胎整倍体率高有关。另外，本研究发现，在移植次数≤2次及年龄<33岁的患者中，D6囊胚移植的早期流产率均显著高于D5囊胚(P<0.05)。该结果与之前文献报道类似，Xu等[18]发现移植D6囊胚的早期流产率显著高于D5囊胚(P<0.05)；还有研究显示D6囊胚的整倍体率显著低于D5囊胚(P<0.05)，推测与流产率升高有关，但具体机制仍有待进一步研究[19]。尽管本研究中移植次数≥3次及年龄≥33岁的患者中D5与D6囊胚移植的早期流产率差异无显著性差异(P>0.05)，但D6囊胚的早期流产率仍有高于D5囊胚的趋势，不排除与该亚组样本量少有关，后续需要进一步开展大样本的前瞻性研究加以验证。

虽然双卵裂期胚胎移植可达到类似单囊胚移植的活产率，但多活胎分娩率也随之升高。临床上有时期望通过移植1枚优胚+1枚非优胚的策略来实现维持临床妊娠率、降低多胎率的目的，在本研究中，移植次数≤2次组及不同年龄分组中，DET-D3组的临床妊娠率及多胎率均显著高于SET-D3优组；在多次组中，DET-D3组的临床妊娠率略低于SET-D3优组，多胎率显著高于SET-D3优组。Zhu等[10]的研究亦认为，尽管单优胚移植的活产率显著低于优+非优的双胚胎移植，但后者的多活胎分娩率显著增高，提示优+非优组合的双胚胎移植并不能有效降低多胎风险。因单胚胎移植组剖宫产率、产前出血、早产、低出生体重、1分钟Apgar评分<7分及新生儿住院率均低于双胚胎移植组，因此Ma等[20]建议40岁以下患者，在有优质胚胎的情况下仍优先选择单胚胎移植。如eSET失败，再次eSET的临床妊娠率、流产率及累积活产率与单周期DET后的临床结局持平，同时有效降低了多胎妊娠率[21]。但是，在推行eSET的过程中，由于部分患者对双胎的偏好甚至超过安全妊娠[22]，这部分患者会认为eSET是一次不必要且成本昂贵的尝试，并且可能延迟其成功妊娠[23]，以及两次eSET的成本并不低于DET[24]，这些因素都可能进一步阻碍eSET的推行。我院在eSET策略的探索中，经过2年的实践证明，eSET可在维持临床妊娠率的同时，明显降低多胎率，因此认为eSET是切实可行的，值得进一步推广应用。但本研究仍存在一定的局限性，首先，由于2021年大部分患者仍未分娩，活产率数据不全，故本研究未对活产率进行统计；其次，部分移植方案亚组间的年龄存在显著性差异，可能会对妊娠结局的统计产生一定影响。后续需进一步完善研究设计加以探讨。

综上所述，对于40岁以内、首次行FET的患者，优先考虑移植1枚D5囊胚，其次为1枚D6囊胚；对于多次移植失败的患者，可选择双优质卵裂期胚胎移植，但需警惕多胎的发生。