姜黄素对大鼠重症急性胰腺炎炎症反应的影响及其机制研究*

蒋春樱，石静，仲海艳

（常州市第四人民医院 消化内科，江苏 常州 213000）

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）是消化科常见危重症，主要表现为胰腺坏死出血，易出现胰腺脓肿、假性囊肿等并发症，伴有脏器功能障碍及代谢功能紊乱等，严重时可导致多器官功能障碍综合征，给患者生命健康带来严重威胁[1]。目前临床尚无有效的特异性方法，因此探寻SAP 治疗方法仍是临床研究的重点和难点。SAP 发病机制复杂，有研究表明SAP 是一种炎症反应性疾病，其炎症反应机制仍未完全阐明[2]。

姜黄素是从中药姜黄中提取出的一种多酚类色素，具有抗炎、抗氧化、抑癌作用[3]。既往研究显示，姜黄素可减轻胰腺炎大鼠胰腺组织损伤，但作用机制尚未完全统一[4-5]。既往研究显示，抑制JAK2/STAT3 通路活化可减轻胰腺炎大鼠肠道功能损伤及炎症反应[6]。石青青等[7]研究显示，姜黄素可通过抑制JAK2/STAT3 通路活化，减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤。目前姜黄素对胰腺炎胰腺组织损伤的保护作用是否与调控JAK2/STAT3 通路有关，少见报道。故本研究基于JAK2/STAT3 通路探究姜黄素对SAP 大鼠胰腺炎症的影响，以期为治疗SAP 提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50 只SPF 及SD 大鼠，10 周龄，体重190～220 g，平均（205±15）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2021-0264。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂姜黄素，规格25 g，纯度＞95%（上海广锐生物科技有限公司），牛磺胆酸钠，规格20 mg（滁州仕诺达生物科技有限公司），醋酸地塞米松溶液，规格25 mg（深圳振强生物技术有限公司），白细胞介素6（interleukin-6, IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（上海广锐生物科技有限公司），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色试剂盒（上海吉至生化科技有限公司），兔抗鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体及山羊抗兔HRP 二抗（上海依赫生物科技有限公司）。

1.2.2主要仪器Optima™XPN 超速离心机（美国贝克曼库尔特生物科技有限公司），BSA2202S-CW型电子分析天平（北京科邦兴业科技有限公司），BD-SW50 光学显微镜（深圳市博视达光学仪器有限公司），Selectra E 型全自动生化分析仪及其配套试剂（上海玉研科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1SAP 模型的复制及分组将50 只大鼠随机分为假手术组、SAP 模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组、阳性对照组，每组10 只。其中SAP 模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组、阳性对照组大鼠自由饮水、禁食12 h 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定于手术台。常规消毒、铺巾后，于腹部正中切开，暴露十二指肠，识别胰胆管汇入十二指肠系膜乳头开口处，在其下缘肠壁无血管区用注射器针头穿刺，置入5 cm 硬膜外导管并朝向开口方向缓慢推进5 cm，结扎胰胆管下段及硬膜外导管，于导管末端连接输液转换器，泵入5%牛磺胆酸钠溶液（1 mL/kg），流速为0.2 mL/min，2 min后胰腺组织出现水肿、出血等，去除结扎丝线及动脉夹，复位十二指肠并逐层缝合腹壁[8]；假手术组大鼠仅翻动十二指肠、胰腺，不穿刺注药，其余操作同SAP 模型组。

1.3.2药物处理模型复制过程中SAP 模型组、姜黄素低剂量组大鼠各死亡1 只，均剩9 只。SAP模型复制完成后，姜黄素低、高剂量组大鼠即刻腹腔注射姜黄素50 mg/kg、200 mg/kg[9]，阳性对照组腹腔注射2 mg/kg 地塞米松[10]，假手术组、SAP 模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水。以上药物均连续使用3 d。

1.3.3标本采集各组大鼠药物干预结束后进行消毒麻醉，打开腹腔后用干棉球吸取腹水。取腹主动脉血，3 000 r/min 离心10 min，离心半径8 cm，取血清，-80℃保存备用。处死大鼠，取胰腺组织并分为两部分，一部分经4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片，用于病理染色；一部分保存于液氮中，用于蛋白检测。

1.3.4腹水量测定用电子分析天平记录干棉球重量（干重）、吸取腹水后重量（湿重），计算腹水量（mg）=棉球湿重（mg）-棉球干重（mg）[11]。

1.3.5各组大鼠血清淀粉酶（Amylase,Amy）、炎症因子IL-6、TNF-α水平测定 从-80℃冰箱中取出冻存血清样本后解冻，采用全自动生化分析仪测定大鼠血清Amy 水平；ELISA 测定血清IL-6、TNF-α 水平，所有操作严格按照试剂盒说明书进行[12]。

1.3.6HE 染色取各组大鼠胰腺组织，乙醇脱水、透明、石蜡包埋过夜，连续切片厚约6 μm，进行HE 染色[13]。中性树胶封片，采用双盲法，由2 位病理科医师用光学显微镜观察各组大鼠胰腺组织病理学变化后进行病理学评分。病理学评分标准参照改良的Schmidt 法[14]，依据水肿、炎症细胞浸润、腺泡坏死严重程度及范围进行病理学评分。

1.3.7Western blotting 检测各组大鼠胰腺组织JAK2/STAT3 通路蛋白的表达取各组大鼠胰腺组织，制备组织匀浆，提取总蛋白并检测浓度及纯度，电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，分别加入一抗JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3，内参β-actin（均按1∶1 000 稀释），次日加入HRP 标记山羊抗兔二抗（1∶5 000 稀释），室温孵育2 h，显色、显影、定影，根据各蛋白条带灰度值计算目的蛋白相对表达量[15]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠腹水量、血清Amy水平比较

5 组大鼠腹水量、血清Amy 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，SAP 模型组、姜黄素低、高剂量组及阳性对照组腹水量和血清Amy 水平升高（P＜0.05）；姜黄素低、高剂量组及阳性对照组腹水量、血清Amy 水平低于SAP 模型组（P＜0.05）；姜黄素高剂量组及阳性对照组腹水量、血清Amy 水平低于姜黄素低剂量组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠腹水量、血清AMY水平比较 （±s）

表1 各组大鼠腹水量、血清AMY水平比较 （±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与SAP 模型组比较，P ＜0.05；③与姜黄素低剂量组比较，P ＜0.05。

Amy/（u/L）1 381.22±207.19 5 638.78±845.82①4 312.78±647.92①②2 010.12±302.50①②③2 006.12±300.92①②③120.073 0.000组别假手术组SAP模型组姜黄素低剂量组姜黄素高剂量组阳性对照组F 值P 值n 10 991 0 10腹水量/mg 0.68±0.11 6.75±1.02①3.98±0.60①②1.51±0.23①②③1.47±0.23①②③203.527 0.000

2.2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较

5 组大鼠血清IL-6、TNF-α 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，SAP 模型组、姜黄素低、高剂量组及阳性对照组血清IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；姜黄素低、高剂量组及阳性对照组血清IL-6、TNF-α 水平低于SAP 模型组（P＜0.05）；姜黄素高剂量组及阳性对照组IL-6、TNF-α 水平低于姜黄素低剂量组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较 （±s）

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较 （±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与SAP 模型组比较，P ＜0.05；③与姜黄素低剂量组比较，P ＜0.05。

TNF-α/（ng/L）163.01±25.45 468.79±70.32①277.66±41.65①②223.05±3.45①②③226.12±33.93①②③78.874 0.000组别假手术组SAP模型组姜黄素低剂量组姜黄素高剂量组阳性对照组F 值P 值n 10 991 0 10 IL-6/（pg/mL）15.33±2.29 48.96±7.35①37.13±5.57①②28.62±4.30①②③27.97±4.21①②③59.637 0.000

2.3 各组大鼠胰腺组织病理学变化及病理学评分比较

假手术组大鼠胰腺组织结构清晰、形态正常，未见水肿、出血及炎症细胞浸润；SAP 模型组大鼠胰腺组织充血水肿、空泡化样变，可见炎症细胞浸润及腺泡细胞坏死；与SAP 模型组比较，姜黄素低、高剂量组及阳性对照组大鼠上述病理学变化有所改善，且高剂量组及阳性对照组大鼠上述病理学变化更加明显。见图1。

图1 各组大鼠胰腺组织病理学变化 （HE染色×200）

假手术组、SAP 模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组、阳性对照组大鼠病理学评分分别为（1.33±0.20）分、（11.77±0.26）分、（8.69±1.31）分、（5.12±0.77）分、（5.06±0.76）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=254.950，P=0.000）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，SAP 模型组、姜黄素低、高剂量组及阳性对照组组织病理学评分升高（P＜0.05）；但姜黄素低、高剂量组及阳性对照组组织病理学评分低于SAP 模型组（P＜0.05）；姜黄素高剂量组及阳性对照组组织病理学评分低于姜黄素低剂量组（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠胰腺组织JAK2/STAT3 通路蛋白相对表达量比较

5 组大鼠胰腺组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，SAP 模型组、姜黄素低、高剂量组及阳性对照组大鼠胰腺组织p-JAK2/JAK2 和p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；姜黄素低、高剂量组及阳性对照组大鼠胰腺组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量低于SAP 模型组（P＜0.05）；姜黄素高剂量组及阳性对照组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量低于姜黄素低剂量组（P＜0.05）。见表3 和图2。

图2 各组大鼠胰腺组织JAK2/STAT3通路蛋白的表达

表3 各组大鼠胰腺组织JAK2/STAT3通路蛋白相对表达量比较 （±s）

表3 各组大鼠胰腺组织JAK2/STAT3通路蛋白相对表达量比较 （±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与SAP 模型组比较，P ＜0.05；③与姜黄素低剂量组比较，P ＜0.05。

p-STAT3/STAT3 0.23±0.03 0.87±0.13①0.60±0.09①②0.25±0.04①②③0.24±0.05①②③137.095 0.000组别假手术组SAP模型组姜黄素低剂量组姜黄素高剂量组阳性对照组F 值P 值n 10 991 0 10 p-JAK2/JAK2 0.16±0.03 0.99±0.15①0.76±0.11①②0.38±0.06①②③0.35±0.07①②③127.474 0.000

3 讨论

SAP 是多因素诱发、多个脏器受累的炎症反应性危重急腹症，病情凶险，发展迅速，部分患者可引发全身性炎症反应综合征和多种器官衰竭，目前临床仍缺乏有效的特异性治疗方法。姜黄素是我国传统中药，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，且毒性低，副作用较少，对胰腺炎的防治发挥积极作用[16-17]，但治疗机制尚未完全阐明。有研究表明，炎症反应在SAP 导致的多脏器功能损伤中发挥关键作用。

胰腺炎早期特征是胰腺腺泡细胞局部坏死，促进促炎细胞因子，如IL-6、TNF-α 等的产生，并促使这些炎症因子募集到炎症发生部位，从而加剧胰腺损伤及病情进展[18]。由于腹腔内和腹膜后的炎症刺激造成胰腺损伤，导致机体内液体分布改变并在腹腔内大量渗出，形成腹水[19]。血清Amy 是一种用于分解淀粉和高分子多糖的酶类物质，正常人体血清Amy 维持在一定水平，其异常升高常用于诊断胰腺炎[20]。本研究结果显示，SAP 模型组大鼠胰腺组织充血水肿，可见炎症细胞浸润及腺泡细胞坏死，且大鼠腹水量，血清Amy、IL-6、TNF-α 水平及组织病理学评分升高，当姜黄素药物干预后，大鼠胰腺组织上述病理学变化有所改善，且大鼠腹水量，血清Amy、IL-6、TNF-α 水平及组织病理学评分均一定程度降低，说明姜黄素可能通过抑制SAP 大鼠胰腺炎症反应，进而对胰腺组织发挥保护作用。JAK/STAT通路是多种炎症细胞因子信号转导的共同通路之一，可介导多种细胞因子的细胞内信号，其中JAK2/STAT3 是JAK/STAT 通路中一条重要的炎症信号通路，当JAK2 磷酸化反应被激活后，促使下游STAT3基因发生磷酸化反应生成p-STAT3，最终介导机体分泌IL-6、TNF-α 等促炎因子，导致炎症加重[21]。既往研究结果显示，抑制JAK2/STAT3 通路活化能够抑制SAP 大鼠炎症因子分泌，改善大鼠肺功能损伤[22]。本研究结果显示，与假手术组比较，SAP 模型组大鼠胰腺组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量升高，当姜黄素药物干预后，大鼠胰腺组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量一定程度降低，说明姜黄素可能通过抑制JAK2/STAT3 通路活化，抑制炎症反应。

综上所述，姜黄素对SAP 大鼠胰腺损伤发挥保护作用，可能是通过抑制JAK2/STAT3 通路活化，抑制炎症反应来实现的，可为临床有效治疗SAP 提供一定参考。然而本研究并未能明确姜黄素对JAK2/STAT3 通路的具体调控作用，后期应进行深入研究。