MicroRNA-126对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖、侵袭、凋亡的作用及其机制研究*

万彬彬，杨惠琴，胡刚明，邹荣

（1.武汉市第一医院 风湿免疫科，湖北 武汉 430022；2.汉川市人民医院 肾内科，湖北 汉川 431600；3.武汉市第一医院 肾病科，湖北 武汉 430022）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种复杂、慢性、进行性的自身免疫性疾病，影响全世界约1%人口[1]。如果未得到有效治疗，40%～70%患者最终会发展为残疾。目前尚无治疗RA 的特效药物，分析RA 的病因至关重要[2]。类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs）促进RA 的发生、发展，其大量增殖并侵袭进入滑膜和骨组织，分泌炎症细胞因子，发挥促炎症作用[3]。Dickkopf-1（DKK1）蛋白是一种配体蛋白，参与细胞的增殖、分化、凋亡及炎症反应。有研究发现，DKK1 升高与RA 患者早期炎症反应有关[4]。MicroRNA（miRNA）是一种长度约为22 个核苷酸且高度保守的单链RNA，转录后可调控基因表达[5]。有研究发现，miR-126 在RA 患者中下调，并且能抑制RA 小鼠模型中RASFs 介导的炎症因子分泌[6]。但是miR-126 对RASFs 生物学行为的影响和作用机制仍不清楚。本研究主要分析miR-126 通过靶向DKK1 参与RASFs 增殖、侵袭、凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选取2018 年6 月—2019 年9 月在武汉市第一医院就诊的25 例RA 患者的滑膜组织（RA 组），同时收集在本院同期接受膝关节十字韧带断裂重建手术的21 例非类风湿关节炎患者的滑膜组织作为健康组（均无急性或慢性关节异常的病史）。RA 患者男性14 例，女性11 例；年龄39～65 岁，平均（51.25±3.08）岁。正常滑膜组织者年龄35～65 岁，平均（50.94±3.18）岁。本研究经医院医学伦理委员会批准（No：20190618），患者签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.2 排除标准①组织收集前3 个月内接受过RA 相关治疗；②合并恶性肿瘤、血液学疾病、感染或其他炎症；③合并其他骨关节疾病。

1.3 主要试剂及仪器

DMEM培养基血清和抗体（美国Invitrogen公司），胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶（美国Sigma-Aldrich 公司），miR-126 mimic、DDK1 过表达质粒及阴性对照（negative control，NC）（苏州吉玛基因股份有限公司），miRNeasy Mini 试剂盒（美国GE 公司），TaqMan miRNA 试剂盒（美国Thermo Fisher 公司），快速定点诱变试剂盒和Renilla 萤光素酶质粒（上海碧云天生物技术有限公司），LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），基质胶和Transwell装置（美国Corning公司），凋亡试剂盒（Annexin V-FITC 和PI）（北京百普赛斯生物科技股份有限公司），兔单克隆抗体和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000 稀释，#ab6721）（美国Abcam 公司），PVDF 膜（美国Bio-Rad公司），ECL 显色试剂盒（美国Thermo Fisher 公司）。萤光素酶报告基因检测试剂盒和检测仪1000 System（美国Promega公司），流式细胞仪（美国Becton公司）。

1.4 RASFs培养和转染

将RA 患者滑膜组织用2.5 g/L 胰蛋白酶在37℃条件下消化2 h，离心获得RASFs[7]。RASFs 在37℃、5%二氧化碳环境下培养。当细胞生长至接近汇合状态时，即可进行细胞传代，将第3～8 代细胞用于后续实验。

RASFs 分为4 组：对照组、miR-126 组、DKK1组、miR-126+DKK1 组。miR-126 组和DKK1 组分别转染miR-126 mimic、DKK1 过表达质粒，对照组转染等量NC 质粒，miR-126+DKK1 组转染miR-126 mimic 和DKK1。将细胞在6 孔板中培养，当细胞融合至60%时，添加Opti 100 μL和LipofectamineTM2000 5 μL 并孵育5 min 作为试剂A。加入Opti 100 μL mimic 或者DKK1 质粒20 ng/μL 并孵育5 min 作为试剂B。将A 和B 混合在一起孵育20 min。16 h 后更换培养基并收获细胞。

1.5 方法

1.5.1实时荧光定量聚合酶链反应（quantitativerealtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测miR-126的表达 使用miRNeasy Mini 试剂盒提取滑膜组织或RASFs 中总RNA，并用TaqMan miRNA 试剂盒逆转录为cDNA。反应条件：37℃、15 min，98℃、5 min。以cDNA 为模板行qRT-PCR，反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40 个循环，72℃继续延伸4 min。以U6为内参，通过比较循环阈值计算miR-126 相对表达量。qRT-PCR 引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5.2Western blotting检测DKK1蛋白的表达健康组滑膜组织、RA组RASFs裂解后，4℃、12 000 r/min离心5 min 收集总蛋白。通过8% SDS-PAGE 分离每个样本中等量（50 μg）的蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。在室温下将膜浸入5%脱脂牛奶中2 h，封闭非特异性抗原。将膜与兔单克隆抗体在4℃条件下孵育过夜，然后将膜与相应的辣根过氧化物酶耦联的二抗在室温下孵育1 h。使用ECL 显色试剂盒显影，使用Quantum One 软件分析灰度，计算DKK1 蛋白相对表达量。

1.5.3双萤光素酶报告检测miR-126 和DKK1 的靶向关系通过Starbase 得到miR-126 与DKK1 的碱基结合位点。将野生型（Wt）的DKK1 序列扩增到pGL4 萤光素酶载体的下游位点，使用快速定点诱变试剂盒生成突变型（Mut）DKK1。将RASFs 细胞按3×104/孔的密度接种在24 孔板中，24 h 后使用LipofectamineTM2000 将1 μg Wt/Mut-DKK1 萤光素酶质粒转染细胞，然后分别转染50 nmol/L miR-126 mimic（miR-126 mimic 组）或者miR-126 NC 质粒（miR-126 NC 组）。细胞在37℃下孵育36 h，使用双萤光素酶报告基因检测试剂盒检测萤光素酶活性。所有数据以Renilla 萤光素酶活性进行标准化。

1.5.4CCK-8法检测细胞活力将100 μL 细胞悬浮液添加到96 孔板中孵育48 h，将10 μL CCK-8 溶液添加到每个孔中并孵育2 h。用酶标仪在450 nm波长处检测每个孔的光密度（optical density, OD）值，间接反映细胞活力。

脂类是生物的能量储存库，是构成生物膜的重要物质，对机体具有重要的生物学作用和生理学调控功能[12,13]。蟹类的体脂含量受温度和气候的影响较大[14]。不同规格的中华绒螯蟹在囤养期间受时间阶段的影响波动较大，可能是由于囤养阶段温度太低，不同规格的蟹应对环境的耐力不同，导致囤养阶段脂含量的不同。

1.5.5Transwell 实验检测细胞侵袭力将基质胶（1∶8 稀释）加入上室，并在37℃条件下孵育30 min。将600 μL 完全培养基填充到24 孔板Transwell 下室，37℃条件下，将各组细胞置于无血清培养基中培养24 h 进行饥饿处理。消化后向Transwell 上室中加入100 μL 细胞溶液（5×105个细胞/mL），24 h 后洗去未侵入的细胞。渗入下室的细胞用95%乙醇固定，0.1%结晶紫室温染色20 min，最后在400 倍视野中随机选取5 个视野计数细胞。

1.5.6流式细胞术检测凋亡将细胞用PBS 洗涤并悬浮在100 μL 结合缓冲液中。分别加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，并在室温下黑暗中孵育10～15 min。最后将400 μL 结合缓冲液添加到样品中，并在1 h 内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验；两组比较用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康组与RA 组滑膜组织miR-126 和DKK1蛋白相对表达量比较

健康组和RA组滑膜组织miR-126相对表达量分别为（0.32±0.03）和（1.01±0.02），经t检验，差异有统计学意义（t=16.855，P=0.000），RA组低于健康组。健康组和RA 组滑膜组织中DKK1 蛋白相对表达量分别为（0.46±0.03）和（1.03±0.12），t检验，差异有统计学意义（t=27.921，P=0.000），RA组高于健康组。见图1。

图1 健康组和RA组滑膜组织中DKK1蛋白的表达

2.2 miR-126与DKK1的靶向关系

miR-126 与DKK1 的靶向结合位点见图2。miR-126 NC 组、miR-126 mimic 组与DKK1 Wt 共转染后的相对萤光素酶活性比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），miR-126 mimic 组低于miR-126 NC 组，证明miR-126 与DKK1 靶向结合。miR-126 NC 组、miR-126 mimic 组与DKK1 Mut 共转染后的相对萤光素酶活性比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图2 miR-126与DKK1 mRNA 3＇端的非翻译区域结合位点

表2 不同转染方式的细胞相对萤光素酶活性比较 （±s）

表2 不同转染方式的细胞相对萤光素酶活性比较 （±s）

组别miR-126 NC组miR-126 mimic组t 值P 值DKK1 Wt 1.03±0.11 0.52±0.03 27.013 0.008 DKK1 Mut 1.09±0.02 1.01±0.07 1.236 0.935

2.3 各组RASFs中miR-126和DKK1蛋白相对表达量比较

对照组、miR-126 组、DKK1 组、miR-126+DKK1组RASFs 中miR-126 相对表达量分别为（1.02±0.02）、（5.09±0.18）、（0.81±0.03）和（3.82±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F=34.528，P=0.000），miR-126 组高于对照组（P＜0.05），提示转染成功。

对照组、miR-126 组、DKK1 组、miR-126+DKK1组RASFs 中DKK1 蛋白相对表达量分别为（1.02±0.07）、（0.39±0.05）、（3.82±0.06）和（0.91±0.05），经方差分析，差异有统计学意义（F=31.016，P=0.000）。进一步两两比较结果：DKK1 组高于对照组（P＜0.05）；miR-126 组低于对照组（P＜0.05）；miR-126+DKK1 组高于miR-126 组（P＜0.05），但低于DKK1 组（P＜0.05）。见图3。

图3 各组RASFs中DKK1蛋白的表达

2.4 miR-126和DKK1对RASFs增殖的影响

对照组、miR-126 组、DKK1 组、miR-126+DKK1组RASFs 的OD 值分别为（0.72±0.06）、（0.59±0.05）、（0.91±0.09）和（0.70±0.07），经方差分析，差异有统计学意义（F=22.361，P=0.000）。进一步两两比较结果：miR-126 组低于对照组（P＜0.05）；DKK1 组高于对照组（P＜0.05）；miR-126+DKK1 组高于miR-126 组（P＜0.05），但低于DKK1 组（P＜0.05）。

2.5 miR-126和DKK1对RASFs侵袭的影响

对照组、miR-126 组、DKK1 组、miR-126+DKK1组RASFs的侵袭细胞数分别为（65.38±3.62）个、（31.76±2.54）个、（119.04±4.27）个和（62.58±3.77）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=38.214，P=0.000）。进一步两两比较结果：miR-126 组低于对照组（P＜0.05）；DKK1 组高于对照组（P＜0.05）；miR-126+DKK1 组高于miR-126 组（P＜0.05），但低于DKK1 组（P＜0.05）。见图4。

图4 各组RASFs侵袭细胞数 （×400）

2.6 miR-126和DKK1对RASFs凋亡的影响

对照组、miR-126 组、DKK1 组、miR-126+DKK1组RASFs 的凋亡率分别为（5.59±0.53）%、（18.74±1.06）%、（3.61±0.34）%和（10.62±0.99）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=35.014，P=0.000）。进一步两两比较结果：miR-126 组高于对照组（P＜0.05）；DKK1 组低于对照组（P＜0.05）；miR-126+DKK1 组高于miR-126 组（P＜0.05），但低于DKK1 组（P＜0.05）。见图5。

图5 各组RASFs流式细胞术图

3 讨论

RA 表现为滑膜增生、炎症和骨质破坏。除关节受累外，病程较长的RA 患者还可能有各种关节外表现，如间质性肺疾病、心血管疾病等，极大地增加了患者和社会的负担[8]。现阶段，RA 的主要治疗方法是对症治疗，以及抗炎、免疫抑制、中药治疗[9]，尚无特效根治药物。因此分析其发病机制对于探究新的RA 治疗药物和方法具有重要意义。

RASFs 是维持关节正常结构和功能的重要细胞，也是RA 的主要靶细胞，抑制其病变是缓解RA的重要方法[10]。RA 中RASFs 会过度增殖，一方面，大量的RASFs 会促进炎症细胞因子分泌，促进RA发展；另一方面，RASFs 也会侵袭进入软骨甚至骨组织，导致关节膨大、活动性降低[11-12]。miRNA 可在转录后调控细胞中蛋白表达水平，进而调节细胞功能和生物学行为[13]。近年来，目前越来越多的研究发现，miRNA 在RA 的发生、进展中发挥关键作用，如miR-20a 调节RA 中RASFs 增殖和凋亡，促进RA 病情进展[14]。miR-126 是一种新发现的RA 相关miRNA。有研究显示，RA 患者miR-126 显著降低，并且miR-126 降低与疾病严重程度有关[15]。然而，也有研究显示RA 患者miR-126 升高，目前miR-126在RA 中的意义仍不清楚[16]。本研究结果表明，RA患者滑膜组织miR-126 相对表达量降低。为分析miR-126 对RASFs 生物学行为的影响，利用RA 患者滑膜组织构建了原代RASFs，并通过转染提高细胞中miR-126 表达，结果显示miR-126 会显著抑制RASFs 的增殖和侵袭，并诱导其凋亡。WANG 等[17]的研究显示，miR-126 通过VEGF-Notch 信号通路，促进青光眼大鼠视网膜神经节细胞凋亡。也有研究发现，miR-126 通过下调抗凋亡蛋白MCL，诱导骨髓瘤细胞系Karpas707 凋亡，抑制增殖[18]。结合文献报道和本研究结果，提示miR-126 缺失可能会减少RASFs凋亡并促进RASFs 过度增殖和侵袭，从而导致关节异常。

DKK1 蛋白通过抑制LRP5/6 与Wnt 的相互作用，以及与促进LRP5/6 内化来拮抗经典的Wnt 通路的信号传导[19]。DKKs 在脊椎动物发育中发挥重要作用，其可局部抑制Wnt 调节过程，调控肢体发育、体节发生和眼睛形成。最新临床研究显示，治疗后RA 患者血清DKK1 水平降低，并且滑膜组织病变得到缓解[20]；并且DKK1 靶向型siRNA 削弱了RA 中RASFs 活性[21]。此外，DKK1 受到miRNA 的靶向调节，miR-BART10-3p 可通过靶向抑制DKK1 水平，抑制细胞增殖和侵袭[22]。本研究结果显示，RA 患者滑膜组织中DKK1 水平显著高于健康者，其变化趋势与miR-126 相反。通过预测和验证，本研究证实miR126 能够与DKK 靶向结合，并抑制DKK1 蛋白的表达。细胞实验结果显示，过表达DKK1 显著促进RASFs 的增殖和侵袭，并抑制凋亡。此外，过表达DKK1 显著缓解miR-126 对RASFs 增殖和侵袭的抑制作用，并缓解miR-126 对RASFs 凋亡的促进作用。本研究结果提示，RASFs 中miR-126 降低可能会引起DKK1 蛋白过表达，而过表达则可通过靶向抑制DKK1 蛋白，缓解RA 患者RASFs 病变。

然而，本研究也存在不足之处，其中miR-126 在RA 滑膜中的表达特点仍需要扩大样本进行分析，关于miR-126 通过靶向DKK1 对RASFs 增殖、分化和氧化应激的影响仍需要体内实验来证实。综上所述，miR-126 在RA 滑膜组织中低表达，miR-126 可通过靶向DKK1，抑制RASFs 增殖、侵袭及凋亡。