健骨胶囊对成骨样细胞MC3T3-E1增殖及分化作用机制

贾玉岩 周振薇 王旭凯 杨宇安 刘茜 幺宝金* 冷向阳*

1.长春中医药大学中医学院，吉林 长春 130117

2.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117

3.长春中医药大学附属医院骨科，吉林 长春 130021

4.长春中医药大学附属医院继续教育学院，吉林 长春 130117

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种慢性骨病，其特征是骨骼的微观结构和宏观结构异常，导致骨质减少和脆弱骨折的风险增加[1]。骨质疏松症的发生率随着年龄的增长而逐渐增加，人口老龄化现象将导致世界人口骨质疏松症的比例增加[2]。

祖国医学将骨质疏松症归属为“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴，根据中医“肾主骨生髓”理论，总结得出本病病因病机主要由于肾精亏虚[3]。大量研究表明，中医药在防治骨质疏松症中有其独特的优势和疗效，有效地改善骨密度及临床症状[4]。

国医大师刘柏龄教授擅长治疗脊柱疾病、关节炎等骨科常见病症[5]。20世纪50年代初，刘柏龄教授依据“肾为先天之本”，创立“治肾亦治骨”的学术思想，这是近现代最早记载的“肾主骨”相关文献[6]。基于这一学术思想，创立补肾健骨治则，研发院内制剂“健骨胶囊”，在长期的临床实践和治疗中，具有很好的疗效且安全性高。

本研究以MC3T3-E1细胞为对象，观察健骨胶囊提取物对成骨细胞的增殖、迁移和分化的影响，从分子生物学水平上探讨健骨胶囊防治骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞：MC3T3-E1细胞株(美国ATCC)。

1.1.2实验药物：健骨胶囊组成：熟地黄67.5 g(河北万修药业有限公司，批号：210101CP102)；淫羊藿67.5 g(河北万修药业有限公司，批号：200801CP614)；骨碎补45 g(河北仁心药业有限公司，批号：23620010)；肉苁蓉45 g(安国市誉林药业有限公司，批号：191201)；鹿角霜45 g(河北万修药业有限公司，批号：201201CP497)；牡蛎67.5 g(安国市安兴中药饮片有限公司，批号：200801CP614)；龟甲45 g(安国市安兴中药饮片有限公司，批号：201201)；黄芪45 g(河北仁心药业有限公司，批号：28121032)；当归31.5 g(安国市安兴中药饮片有限公司，批号：201206)；鹿衔草31.5 g(安国市安兴中药饮片有限公司，批号：200801)；鸡血藤31.5 g(安国市安兴中药饮片有限公司，批号：201401)；杜仲31.5 g(安国市安兴中药饮片有限公司，批号：201202)；陈皮22.5 g(安国市安兴中药饮片有限公司，批号：201302)；三七22.5 g(酒泉市塔丰中药村生态种植加工有限公司，批号：201201)；莱服子22.5 g(河北仁心药业有限公司，批号：24920013)。

1.1.3试剂：NEST细胞培养板；DMEM高糖培养基(美国 HyClone公司，批号：AG29642090)；胎牛血清(以色列Biological Idustries公司，批号：2053264)；胰蛋白酶(美国MRC公司，批号：T210118)；青霉素-链霉素双抗溶液(美国Med Chem EW xpress公司，批号：98259)；茜素红染料(Alizarin red)(北京索莱宝科技有限公司，批号：919G0033)；CCK8试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，批号：BA03175388)；荧光定量PCR试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司，批号：AKE1146A]。

1.1.4仪器：Heto Power Dry LL3000型冷冻干燥机(美国LABCONCO 公司，型号：CORPORATION KANSAS CITY，MISSOURI 64132)；CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)；荧光定量PCR仪(美国 Bio-Rad公司，型号：CFX ConnectTM Optics Modulie)；大屏幕数码倒置显微镜(日本Olympus公司)；Infnite 200 PRO型酶标仪(瑞士TECAN公司，型号：INFINITE 200 PRO)；光学显微镜(日本Olympus公司)；高速离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 实验方法

1.2.1健骨胶囊提取物的制备：本实验所使用的健骨胶囊方由长春中医药大学附属医院国医大师刘柏龄提供，组方共含有15种中药，包括熟地黄、淫羊藿、骨碎补、肉苁蓉、鹿角霜、牡蛎、黄芪、龟甲、当归、鹿衔草、鸡血藤、杜仲、陈皮、三七、莱服子。健骨胶囊提取物制备方法如下：(1)上述药物按固定计量混合后浸泡2 h；(2)浸泡后的药物置于砂锅中100 ℃沸水中煎煮30 min后，用纱布过滤收集药液，重复上述操作2次；(3)将3次滤得的药液使用冷藏离心机离心。收集上清液通过中空纤维膜滤柱过滤进一步澄清，并在-80 ℃储存过夜，隔日使用冷冻干燥机冻干。

1.2.2细胞培养：MC3T3-E1细胞每3 d传代1次，培养基组成(DMEM培养基加入胎牛血清10 %及青霉素-链霉素溶液1 %)，取对数生长期细胞用于本实验。

1.2.3CCK-8细胞增殖实验：将消化重悬后的细胞接种于96孔板，每孔细胞数为3 000个，共设置7个不同浓度的含健骨胶囊提取物溶液分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL，每组设3个复孔。培养48 h后，分别向每孔加入10 μL CCK8工作液，培养箱中37 ℃条件下孵育1 h，检测450 nm波长处的吸收值。

1.2.4细胞划痕实验：进行细胞划痕损伤实验，以评估细胞迁移能力。将消化重悬后的细胞接种于6孔板，每孔细胞数密度为1×105/mL，用培养基培养至细胞融合度为100 %，后用枪头刮擦，PBS清洗后，细胞分别用1.6 mg/mL的DMEM及健骨胶囊溶液处理，对细胞初始划痕状态要拍照留存，放入培养箱中培养，8、16和24 h后，镜下观察，并记录拍照，以观察细胞的迁移情况。

1.2.5茜素红染色及定量：将MC3T3-E1细胞接种24孔细胞培养板中，每孔20 000个细胞。实验组细胞用基于细胞增殖测定结果的最佳浓度的健骨胶囊提取物处理，对照组用普通培养基处理，并在含有5 % CO2的培养箱中于37 ℃孵育7 d，隔天换液。7 d后取出所有培养基，用PBS洗涤细胞2次。加入95%乙醇在室温下进行细胞固定15 min。用ddH2O洗涤3次后，将固定细胞在室温下置于摇床上，用1 %茜素红S染色液染色0.5 h，用ddH2O洗摇5 min，洗摇操作重复4次。染色后用体式显微镜及大屏幕数码倒置显微镜4倍和10倍镜下拍摄。通过在室温下用10 %乙酸溶解染色的细胞0.5 h并轻轻摇动进行定量分析，随后涡旋30 s、加入200 μL液体石蜡，85 ℃水浴10 min，12 000 rcf离心5 min，取下清液用10 %氨水中和pH至4.1，使用酶标仪在405 nm的光密度下进行定量分析。

1.2.6QRT-PCR检测成骨相关mRNA的表达在药物干预的第24小时进行Real-time PCR检测：6孔细胞培养板，每孔细胞数密度为5×105cells/mL，实验组和对照组加药培养24 h，吸除培养基，用PBS冲洗2次后每孔加入Buffer RZ 1 mL，裂解5 min后吹洗，并将转移入1.5 mL离心管中，按照TIANGEN总RNA提取试剂盒操作方法提取RNA，测浓度定量。将制备好的健骨胶囊组和空白组的MC3T3-E1细胞总RNA，通过反转录步骤得到cDNA；使用SYBR荧光染料进行qRT-PCR实验，具体实验反应体系配置见表1。按预设程序，将反应液放置于荧光定量PCR仪中反应。阶段1(1次循环)：95 ℃ 3 min；阶段2(40次循环)：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s。数据处理：扩增完毕后，得到目的基因及内参基因表达的CT值，采用2-ΔΔCT法进行相对定量分析[7]。Gapdh、Runx2，Col1a1、Ocn、Opn、Bcl2、Alp，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成，引物序列见表2。

表1 qRT-PCR实验反应体系Table 1 qRT-PCR experimental reaction system

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2.7蛋白质印迹法(Western blot)：6孔细胞培养板，每孔细胞数密度为5×105cells/mL，实验组和对照组加药培养24 h，吸除培养基，用PBS冲洗2次后每孔加入蛋白裂解液，裂解30 min后吹洗。收集蛋白后上样于10 % SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃条件下孵育过夜，隔日更换二抗，室温孵育2 h，显色、分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞增殖的影响

本研究以空白培养基为实验对照，实验组加入不同浓度的健骨胶囊提取物溶液干预MC3T3-E1细胞，结果表明(图1)，与对照组比健骨胶囊提取物能明显促进MC3T3-E1细胞的增殖(**P<0.01)，且在浓度为1.6 mg/mL时，细胞增殖效果最好，后续实验也采取该浓度进行。

2.2 对MC3T3-E1迁移的影响

检测健骨胶囊方含药血清对MC3T3-E1细胞迁移能力的影响，进行细胞平板划痕实验，并在划痕后0、8、16、24 h进行拍照、分析。如图3所示，在第8小时加药组与空白组无明显差异，在第16小时可以明显发现加药组具有更好的向空白区域迁移的能力；在第24小时可以发现加药组已经完全将空白区覆盖，然而空白组仍存在部分区域空白区。因此可以发现在健骨胶囊含药血清的干预下MC3T3-E1迁移能力明显增强。见图2。

2.3 健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞成骨矿化的影响

药物干预7 d后，茜素红染色矿化结节健骨胶囊提取物组优于空白组，茜素红染色定量显示实验组对细胞成骨矿化能力明显优于对照组(**P<0.01)，见图3。

2.4 对MC3T3-E1成骨相关mRNA表达的影响

MC3T3-E1细胞经健骨胶囊胶囊提取物干预24 h后，与空白组比较，Runx2、Ocn、Col1a1、Alp、Opn的 mRNA表达显著升高(**P<0.01)，Bcl2的mRNA表达升高(*P<0.05)，与成骨细胞相关mRNA上调趋势相同，且结果均有统计学意义。见图4。

2.5 对MC3T3-E1成骨相关蛋白表达的影响

MC3T3-E1细胞经健骨胶囊提取物干预24 h后，与空白组比较，Col1、Bcl2的蛋白表达升高。见图5。

3 讨论

目前西医治疗骨质疏松症主要通过雌激素以及双膦酸盐类药物为主[8]，虽然治疗效果明显，但也会引起一些肝肾及骨骼方面的不良影响。而中医药治疗骨质疏松症，在疗效显著的同时具有不良反应小、成本低的特点。

健骨胶囊是国医大师刘柏龄教授从医60余载总结归纳出的经验方，具有补肾健骨，养血舒筋，通络止痛的功效[9-10]。本方君药熟地黄，甘温味厚，质地柔润，入肾补肾，滋肾水，益肾阴，为补肾阴之要药；臣药为淫羊藿、骨碎补、肉苁蓉、鹿角霜、龟甲、杜仲均有补肾健骨，填精生髓的功效；佐药牡蛎、黄芪、当归、三七、鸡血藤滋阴潜阳，活血生新，以壮肾髓；使药为陈皮、莱菔子，调和诸药，促进脾胃运化。

基于本研究实验结果发现健骨胶囊能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖及细胞迁移能力，并通过上调成骨细胞特定基因及蛋白的表达，提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。这对中药治疗骨质疏松症的实验室研究和临证诊疗提供良好的理论基础，由于中药治疗疾病具有多靶点多途径的特性，对于进一步探究其治疗其他骨科疾病的作用效果及分子机制做铺垫，同时为国医大师刘柏龄“肾主骨”理论临床诊疗的探寻提供一种思路。

由于临床上中药复方制剂常用给药途径为口服给药，因此本研究采用健骨胶囊提取物冻干粉直接干预MC3T3-E1细胞的方法存在一定的局限性。由于不同药物生物利用度差异，冻干粉与药物服用后的入血成分可能会存在不同，因此在今后的研究中将进一步采用动物实验对健骨胶囊的分子机制做更加系统和深入的研究。鉴于本课题组在前期研究中，针对中药复方及中药材提取物进行了一系列的体内外活性及生物学机制研究，发现这些中药制剂在细胞水平与动物水平上的药效活性基本一致，因此，本研究基于细胞水平的研究将对后续更加深入的动物水平研究具有一定的指导作用[11-13]。