通过p38 MAPK信号通路探讨仙灵骨葆胶囊对MC3T3-E1成骨分化的影响

张岩 董万涛 安文博 张碧峰

甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨组织微结构破坏、骨量丢失、骨强度下降为主要特征的全身代谢性骨病，后期极易并发重要部位骨折[1]。随着人口结构的改变，OP的患病率逐年上升，截至2020年全球OP的患病人数已突破10亿[2]，OP及脆性骨折是导致老年人群躯体功能障碍和死亡的常见原因，高额的医疗投入与沉重的经济负担，是世界各国在OP防治领域所面临的重要难题[3]。OP的病理机制复杂，主要的发病机制是破骨细胞与成骨细胞之间的动态平衡被破坏，骨代谢紊乱，骨吸收作用大于骨形成[4]。目前针对OP的临床治疗方案，主要以促进骨形成、抑制骨吸收，维持骨代谢的正向平衡为主，中药制剂仙灵骨葆胶囊在OP的防治中疗效显著[6]。p38 MAPK信号通路在维持骨组织的稳态方面具有重要调控作用，马茜等[7]研究发现葛根素能促进MC3T3-E1的分化和增殖，并且证实这与激活p38 MAPK信号通路有关。本研究通过体外培养MC3T3-E1并用仙灵骨葆胶囊含药血清干预，检测p38 MAPK信号通路相关蛋白及mRNA 的表达水平，探讨仙灵骨葆胶囊通过p38 MAPK信号通路对MC3T3-E1增殖分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物与细胞：40只SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体重(180±20) g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(甘)2011-0001；MC3T3-E1细胞株由武汉普诺赛生命科技有限公司提供(货号：CL-0387)。

1.1.2药物与试剂：仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司，国药准字Z20025337，规格0.5 g/粒)；CCK-8试剂盒，日本同仁化工；胎牛血清、DMEM培养基、0.25 %胰蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；Runx2、BMP-2，Servicebio；p38、p-p38抗体，Abcam；p38 MAPK通路抑制剂SB203580、ALP试剂盒，天津正济科技有限公司。

1.1.3主要实验仪器：二氧化碳培养箱，日本SANYO公司，MCO-18AIC[UV]；低温高速离心机、连续波长酶标仪、荧光定量PCR仪，美国Kendro公司，型号分别为041BR109973、Benchmark Plus、C1000；光学显微镜OlymPus公司，IX51。

1.2 方法

1.2.1MC3T3-E1细胞的传代培养：复苏原代的 MC3T3-E1，转移至含有10 %胎牛血清和DMEM培养基的培养瓶中，放入CO2培养箱，培养为条件37 ℃、5 % CO2、100 %饱和湿度。待细胞贴壁生长，铺满瓶壁80 %～90 %后用0.25 %胰蛋白酶消化，然后进行传代培养。

1.2.2大鼠含药血清制备：将Wistar大鼠分为空白血清组和含药血清组，每组20只。含药血清组给予仙灵骨葆胶囊溶液灌胃，具体给药剂量为1.26 g/kg，每日两次，连续1周；空白血清组给予等量生理盐水灌胃。末次灌胃2 h后，2 %戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉后心脏采血，静置1 h后以2 800 r/min转速离心5 min，吸取上清液，56 ℃水浴灭活，0.22 μm微孔滤膜除菌后-20 ℃下保存备用。

1.2.3CCK8检测细胞增殖活性：取生长状态良好的第三代MC3T3-E1，调整细胞浓度为1.5×104/mL，分为空白对照组、5 %、10 %、15 %、20 %含药血清组，按每孔200 μL的量接种于96孔板，设置3个复孔。待细胞贴壁后，吸弃原有培养基，空白对照组加入200 μL完全培养基，其余各组加入200 μL含有相应浓度仙灵骨葆胶囊含药血清的培养基，分别在0、12、24、36、48 h时间节点加入10 μL的CCK8试剂，测量各组细胞OD值，设置波长为450 nm。

1.2.4细胞ALP活性检测：将MC3T3-E1接种于6孔板中，根据上述分组加入相应的含药血清成骨诱导分化后，弃去培养基，刮下细胞后加入完全培养液，将混悬液移至离心管，2 000 r/min离心5 min，收集底部白色沉淀物。PBS液洗涤待测样本，超声破碎后进行ALP活性检测，酶标仪波长设置为520 nm。

1.2.5荧光定量PCR检测p38、Runx2、BMP-2 mRNA水平：根据CCK8检测结果，将MC3T3-E1分为A、B、C、D 4组。A组：10 %含药血清组，B组：10 %空白血清组，C组：SB203580+10 %含药血清组，D组：SB203580+10 %空白血清组，各组细胞加入相应的血清以及SB203580(10 μmol/L)，继续培养36 h后，按照Trizol法提取总量RNA，-80 ℃保存待用。对RNA的浓度及纯度进行检测，按后照反转录试剂盒步骤说明反转录合成cDNA，根据cDNA进行荧光定量PCR检测。

1.2.6Western blot检测p38、p-p38、Runx2及BMP-2 蛋白表达：将以上4组细胞培养36 h后弃去培养基，PBS洗涤后加入裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白总浓度，具体步骤均按说明书进行。蛋白变性后进行电泳分离，先后加入一抗、二抗，滴加ECL工作液于PVDF膜上，待荧光带明显后显影、定影，冲洗胶片，运行Image Lab软件分析蛋白相对表达量。

1.3 统计方法

对实验数据的统计处理使用SPSS 24.0软件，计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用多因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 仙灵骨葆胶囊含药血清对MC3T3-E1增殖活性的影响

CCK8结果显示，随着培养时间的顺延，各组细胞的OD值呈上升趋势，36 h节点出现峰值。12 h时，与空白对照组相比，10%浓度含药血清组的OD值明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，36、48 h时，与空白对照组相比，各含药血清组OD值差异均有统计学意义(P<0.05)；在12、24、36、48 h时间节点，10 %含药血清组的OD值明显高于其他各组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 不同浓度仙灵骨葆胶囊含药血清对MC3T3-E1增殖活性的影响Table 1 Effects of conditioned serum of Xianling Gubao capsule at different concentrations on the proliferation activity of MC3T3-E1

2.2 细胞ALP活性检测结果

与空白对照组相比，各含药血清组ALP活性明显升高(P<0.05)；其中10%含药血清组MC3T3-E1细胞ALP活性明显高于其他组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度仙灵骨葆胶囊含药血清对细胞ALP活性的影响Table 2 Effects of conditioned serum of Xianling Gubao capsule at different concentrations on ALP activity of

2.3 细胞形态学观察结果

显微镜下观察MC3T3-E1形态可见，细胞多呈梭形或锥形贴壁生长，A、B组的细胞密度大于C、D组，但细胞形态基本相似，无明显差异。见图2。

2.4 各组细胞p38、Runx2、BMP-2 mRNA比较

如表3所示，A组与其他各组比较，p38、Runx2、BMP-2 mRNA的表达呈高水平，差异有统计学意义(P<0.05)；加入阻断剂后C组与D组上述基因的表达水平较A、B组明显降低(P<0.05)，与C组相比，D组的下降趋势更为显著(P<0.05)。

表3 不同组别仙灵骨葆胶囊含药血清对p38、Runx2、BMP-2 mRNA表达的影响Table 3 Effects of conditioned serum of Xianling Gubao capsule on the expression of p38, Runx2 and BMP-2 mRNA in different

2.5 各组细胞p38、p-p38、Runx2、BMP-2蛋白的表达情况

A组细胞p38 MAPK信号通路相关蛋白及Runx2、BMP-2的表达量明显高于其他三组，差异具有统计学意义(P<0.05)；B组与D组相比，p38、p-p38、Runx2、BMP-2明显降低(P<0.05)；与C组相比，D组上述指标的表达更低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3、表4。

表4 各组细胞p38、p-p38、Runx2、BMP-2 蛋白的表达量Table 4 Expression of p38, p-p38, Runx2 and BMP-2 proteins in cells of each

3 讨论

根据OP的临床表现与病变特点，归属于中医学“骨痿”“骨枯”“骨极”等范畴[8]。正如《素问·痿论》所言：“肾主一身之骨髓……骨枯而髓减，发为骨痿”，又有《千金要方·骨极》曰“骨极者，主肾也……若肾病则骨极，牙齿苦痛……身痹脑髓酸……故曰骨极”[9]。可见，肾中精气充盛是保证骨骼正常生长、发育的关键因素，若肾虚精亏，则髓空骨枯，导致OP的发生[10]。中医药立足于整体观念与辨证施治体系，在OP的防治中彰显出“简、便、验、廉”的独特优势[11]。仙灵骨葆胶囊是目前临床治疗OP常用的补肾壮骨类中成药制剂，疗效确切、安全性高，由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄六味药组成，全方共奏补肾壮骨、通络强筋之效。前期药理学研究证实，仙灵骨葆胶囊能够调节骨代谢的正向平衡，促进骨的形成与重塑，这一过程涉及多条信号通路以及蛋白分子的调控[12]。

MAPK是信号刺激从外界传至细胞核的关键激酶[13]，p38家族是一组在进化上高度保守的MAPK，也属于丝氨酸/苏氨酸激酶。p38 MAPK信号通路在细胞的生长、分化、凋亡中发挥着重要的生物学功能，越来越多的证据表明，与骨代谢相关的大部分调节因子主要通过p38 MAPK途径起作用[14]，从而维持骨骼的健康，p38 MAPK通路的激活能有效防治OP以及增龄性的骨量流失、骨强度下降。Lu等[15]研究发现，低幅度高频振动在骨组织的合成代谢中具有正向的调控效应，其作用机制与促进体外间充质干细胞的成骨分化密切相关，而p38 MAPK信号通路在低幅度高频振动诱导的成骨中显示出重要功能。Liu等[16]通过实验证实，细胞松弛素D是一种潜在改善MC3T3细胞成骨分化的药物，其主要通过p38 MAPK信号转导系统促进MC3T3细胞的增殖分化。陈泽群等[17]也研究发现，艾塞那肽能够通过p38 MAPK信号通路抑制棕榈酸钠诱导的成骨细胞的凋亡，并提高细胞的活力。

本研究结果表明，不同浓度的仙灵骨葆胶囊含药血清均能促进MC3T3-E1的增殖活性，作用效果呈现浓度和时间的依赖性。其中，10%的含药血清干预36 h后最为明显，能显著提高ALP的活性。为了验证仙灵骨葆胶囊促进MC3T3-E1成骨分化的分子学机制，进一步检测了p38 MAPK信号通路相关的蛋白基因。与空白血清相比，仙灵骨葆胶囊含药血清能够明显上调p38、Runx2、BMP-2蛋白及mRNA的表达水平。加入信号通路阻断剂SB203580后，含药血清组p38、p-p38、Runx2、BMP-2蛋白及p38、Runx2、BMP-2 mRNA的表达仍高于空白血清组，说明仙灵骨葆胶囊具有促进MC3T3-E1成骨分化的作用，其分子机制可能与激活p38 MAPK信号通路、上调成骨相关因子Runx2、BMP-2的表达有关。但仙灵骨葆胶囊在OP的防治中具有多途径、多靶点、多系统的作用特点，通过p38 MAPK信号通路调控骨代谢的正向平衡是治疗OP的一个方面，在今后的研究中要借助生物信息学技术进行更加深入、全面的探索，以期揭示其具体的作用机理。