中医不同治法诱导肌源性干细胞向成骨细胞诱导分化中SDF-1蛋白表达的比较研究

付夜平 杨芳 孙鑫 邸贵鑫 安勇

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032

骨痿是“五体痿”之一，最早见于《素问·痿论》：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”其病机为肾气亢盛，灼伤津液，髓骨不充，从而导致骨痿[1]。中医学认为，骨痿的发生与脾、肾相关，脾虚是关键，肾虚为本源[2]。如《证治汇补·腰膝门》所言：“胃气一虚，……，骨节空虚。”肾为先天之本主骨生髓，而脾为后天之本，脾主肌肉，先天资后天，后天养先天，因此前人提出“骨肉不相亲”理论。由此理论推断肌源性干细胞(MDSCs)应该存在向成骨细胞转化的可能。笔者查阅相关文献资料，发现基质细胞衍生因子-1(SDF-1)广泛存在于人体的组织器官以及细胞之中，并且有相关研究表明SDF-1与成骨分化存在密切联系。BMP-2是已知的BMP家族生长因子中活性最强的生长因子[3]，所以本研究采用人骨形态发生蛋白2(BMP-2)为诱导剂，通过中医补肾阴法、补肾阳法、健脾法、补肾健脾法，探讨中医不同治法诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)向成骨细胞分化中成骨细胞中SDF-1 mRNA的表达情况，为中医在骨科疾病的病机研究以及治疗中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及细胞：选取SD大鼠(SPF级)60只，雌性，未交配，2～3月龄，体重180～220 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验单位使用许可证编号：SYXK(辽)2013-0009；大鼠饮用水为纯净水，于沈阳茂华生物科技有限公司采购SPF级大鼠生长繁殖饲料[许可证号：SCXK(辽)2017-0001]及垫料，并且均经过辐照消毒；大鼠肌源性干细胞(MDSCs)购自上海佰晔生物科技中心。

1.1.2药物及制备：补肾阴组使用左归丸(熟地、山萸肉、山药、枸杞、牛膝、菟丝子、鹿角胶、龟甲胶)；补肾阳组使用右归丸(熟地、山萸肉、山药、菟丝子、杜仲、枸杞、肉桂、附子、鹿角胶、当归)；健脾组使用补中益气汤(党参、当归、黄芪、白术、炙甘草、柴胡、陈皮、升麻、大枣、生姜)；补肾健脾组(熟地、鹿角胶、党参、黄芪、甘草、淫羊藿)。以上药物均为颗粒剂，购买于辽宁中医药大学附属医院。大鼠胃容积为1 mL/100 g，以此为大鼠配药及灌胃。上述药物按计算比例给药剂量如下：补肾阴组：熟地2.52 g /(kg·d)、山茱萸1.26 g/(kg·d) 、山药1.26 g/(kg·d)、枸杞1.26 g /(kg·d)、牛膝0.945 g/(kg·d)、菟丝子1.26 g/(kg·d)、鹿角胶1.26 g/(kg·d)、龟甲胶1.26 g/(kg·d)；补肾阳组：熟地2.52 g/(kg·d)、山茱萸0.945 g/(kg·d)、山药1.26 g/(kg·d)、菟丝子1.26 g/(kg·d)、杜仲1.26 g/(kg·d)、枸杞1.26 g/(kg·d)、肉桂0.945 g/(kg·d)、制附子0.945 g/(kg·d)、鹿角胶1.26 g/(kg·d)、当归0.945 g/(kg·d)；健脾组：党参1.575 g/(kg·d)、当归1.05 g/(kg·d)、黄芪1.575 g/(kg·d)、白术1.05 g/(kg·d)、炙甘草1.575 g/(kg·d)、柴胡1.26 g/(kg·d)、陈皮0.63 g/(kg·d)、升麻0.63 g/(kg·d)、大枣0.63 g/(kg·d)、生姜0.945 g/(kg·d)；补肾健脾组：熟地1.575 g/(kg·d)、鹿角胶1.26 g/(kg·d)、党参1.575 g/(kg·d)、黄芪1.575 g/(kg·d)、甘草1.575 g/(kg·d)、淫羊藿1.26 g/(kg·d)。将药物置于烧杯之中，加入适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌配置成溶液，并将所配置药物保存在冰箱中，使用时按每日大鼠所需进行加热。

1.1.3试剂：Rat SDF-1 ELISA试剂盒[批号：202011(AMEKO)]；胎牛血清(GIBICO，美国)；茜素红(批号：T190613H501)；双抗(批号：79180101100)；SYBR® Premix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)，ROX plus，厂家：Takara,货号：RR42LR,出厂号AK6948；PBS溶液(批号:AE27369284)；人骨形态发生蛋白2(BMP-2)(批号AG12015747)；0.25 %Trypsin EDTA消化酶 (批号：1868903)；PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser，厂家：Takara,货号：RR047A,出厂号：BK3153。

1.1.4主要仪器：MDF-382 N型超低温冰箱(日本Sanyo)；蛋白核酸分析仪(DU640美国贝克曼)；倒置相差显微镜(1×71型，OLYMPUS日本)；酶标仪(Infinite M200，瑞士TECAN)；移液枪(eppendorf 德国)；荧光定量PCR仪(Stratagene Mx3000P德国安捷伦)；三气培养箱(Oxford Optronix 英国)；台式离心机(德国 JOUANSA，Labofuge 400型)；CO2培养箱(HERA cell50i，Thermo 美国)；超净工作台(1287#6型，Thermo 美国)；低温高速离心机(法国 Jouan SA MR1822)；滤膜(0.22 a m，Mi11 ipore，USA)。

1.2 方法

1.2.1细胞复苏及培养：将复苏后的大鼠肌源性干细胞(MDSCs)制成细胞悬液，将细胞悬液分置两处，一处为6孔板，另一处则在培养瓶中，将二者放入CO2培养箱(37 ℃，5 % CO2)中培养24 h。到时间以后取出，把培养基和不贴壁的细胞吸出，然后取新培养基加入其中，将二者放入培养箱中继续培养。与此同时在镜下观察细胞的培养生长状况(单层贴壁生长)，当细胞生长至80 %～90 %融合后，将旧培养基从中吸出，加入PBS溶液，洗涤2～3次即可，随即加入0.25 %胰蛋白酶，消化1～3 min，与此同时在镜下观察细胞情况。当细胞明显去除后，把完全培养基加入，终止消化，再用移液管吸取完全培养液缓慢吹打瓶壁上的细胞，制备成细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中，1 500 r/min，离心5 min，把上清液吸出丢弃，把离心后的沉淀转移到培养瓶中，加入适量新培养基，将细胞浓度调度至1×105/mL ，把细胞继续转移到CO2培养箱(37 ℃ ，5 % CO2)中，收集后转入第四代进行实验。

1.2.2含药血清制备：用随机数字表法将SPF级3月龄雌性大鼠(体重180～200 g)60只分为6组，依次为正常组、诱导液组、诱导液+补肾阴组、诱导液+补肾阳组、诱导液+健脾中药组、诱导液+补肾健脾中药组。各组大鼠的给药时间为每天早上8点，每日一次，连续给药1周。正常组、诱导组的给药用相同剂量的0.9 % NaCl溶液替代。给药剂量为1 mL/100 g (大鼠重量)，计算方法为按成人每公斤体重所用生药量的6. 3倍灌胃(成人体重按 60 kg 计算)。在第7天早晨给药以后的2 h，用10 %水合氯醛(0.35 mL/100 g)对实验大鼠肌肉行注射麻醉，在无菌条件下进行大鼠腹主动脉血的采集。将采集的腹主动脉血静置于冰箱内(温度为4 ℃)，时间为3～4 h，随后取出进行30 min离心(3 000 r/min)，收集血清，并用水浴(温度为56 ℃)灭活补体(时长30 min)，冷冻保存(温度为-70 ℃)，用0.22 μm滤膜过滤除菌，随后分装在不同试管，做好标记。使用前将含药血清用无血清DMEM把血清浓度调配至15 %。

1.2.3药物血清培养细胞：完全培养液组(正常组)、BMP-2诱导液组(诱导组)、补肾阴组、补肾阳组、健脾组、补肾健脾组等各中药组组成均为15 %对应中药大鼠血清+80 %完全培养液+5 %诱导液。各实验组含药物的培养基加入到各实验组的时间为铺板后的24 h，继而进行连续培养，此外新鲜培养基(不同中药组)的更新替换为3 d /次，培养至第15天收集材料。

1.2.4检测指标及方法

1.2.4.1茜红素染色细胞形态观察：将培养15 d的细胞进行茜素红染色。先将0.1 %明胶(Cyagen)包被在24孔板上，然后将各组样本接种在24孔板上，每竖排4孔为一组，分别标记为正常组、诱导组、补肾阴组、补肾阳组、健脾组、补肾健脾组，分别在细胞培养的第15天取出观察。首先进行两次洗板，溶液使用PBS溶液，随后把多聚甲醛(4 %)加入孔中进行固定，时间为20 min，再清洗两次，清洗溶液为去离子水。继续往每孔加入茜素红(200 μL)，染色时间30 min，到时间以后再用去离子水洗三次。镜下观察茜红素染色细胞形态。

1.2.4.2qRT-PCR法检测SDF-1 mRNA表达情况：在培养的第15天将各组培养细胞的孔板中培养基吸出，加入适量无菌PBS溶液，然后用移液枪不停吹打，使全部细胞从培养板上脱落，还未脱落的细胞用细胞刮勺轻剥离，把细胞与PBS溶液转移到EP管中，离心5 min，将EP管底部沉淀保留，上清液丢弃。随后分别装到不同管内加入Trizol，将总RNA提取出来。根据试剂盒说明书，采用QRT-PCR法检测SDF-1 mRNA的表达,利用公式计算出所得各样品Ct值各样品mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 下游引物Table 1 Downstream primers

1.2.4.3ELISA法检测成骨细胞中SDF-1蛋白表达：细胞收集方法同上，严格按照试剂盒操作说明进行操作检测，标准曲线的回归方程用EXCEL计算，以此计算各指标。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 茜红素染色细胞形态的观察

于镜下观察第15天诱导细胞的生长状态。细胞生长良好，各中药组细胞生长与正常组以及诱导组相比，细胞数量不仅多而且生长较为集中。见图1。

2.2 SDF-1 mRNA表达结果

各组细胞SDF-1 mRNA相对表达量结果见表2。与正常组比较，诱导组、补肾阴组、补肾阳组、健脾组、补肾健脾组中SDF-1 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01)；与诱导组比较，健脾组无统计学意义(P>0.05)，其余组均有显著升高，且具有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组细胞SDF-1 mRNA相对表达量结果分析对比Table 2 Analysis and comparison of relative expression of SDF-1 mRNA in each

2.3 SDF-1蛋白表达

各组细胞SDF-1蛋白相对表达量结果见表3。补肾阴组、补肾阳组、诱导组、健脾组、补肾健脾组SDF-1蛋白表达均高于正常组，其中补肾阴组、补肾健脾组不具有统计学意义(P>0.05)，只有补肾阳组、诱导组、健脾组具有统计学意义(P<0.05)，与诱导组比较，各给药组SDF-1含量均高于诱导组，其中补肾阴组、补肾阳组、健脾组具有统计学意义(P<0.05)，补肾健脾组SDF-1含量虽然也高与诱导组，但无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组细胞SDF-1蛋白相对表达量结果分析对比Table 3 Analysis and comparison of relative expression of SDF-1 mRNA in each group

3 讨论

3.1 中医学对“骨肉不相亲”病机的认识

“骨肉不相亲”理论出自《灵枢·经脉》：“故骨髓不濡，即肉不着骨；骨肉不相亲，即肉濡而却”。这是对骨肉关系最为经典且最早的论述[4]。其认为：肾生髓主骨，主生殖而能藏精，脾主四肢，合肌肉，能运化水谷精微[5]。《灵枢·经脉》又言：“足少阴气绝，则骨枯。……骨肉不相亲，则肉软却；肉软却，故齿长而垢，发无泽；发无泽者，骨先死。戊笃己死，土胜也。”说明肌肉痿软，甚至齿发枯槁无泽的根本归结于肾气不得濡养于骨，即“骨肉不相亲。”《素问·五运行大论》云：“肾生骨髓。”《素问·五脏生成》曰：“脾之合肉也”。《素问·痿论》：“脾主身之肌肉，肾主身之骨髓。”肾藏精，髓源于精，髓充于骨。骨骼是否强壮的关键因素在于肾精是否充足，若肾精充盈则骨髓充盛，进而体现出骨骼强健，壮实有力。充盈于肾中之精，不仅温养骨髓，而且还能助脾运化，则气血生化并不乏源，四肢百骸得以濡养，同时肾精的填补，肾气的滋养又需要充盈的气血来反养，是以先天养后天，后天资先天，相互促进，似环无端。肾中阳气可以温煦助力脾之运化，肾中先天之精也需要由脾运化的后天之精之充补。《素问·太阴阳明论》言：“今脾病不能为胃行其津液，……筋骨肌肉，皆无气以生，故不用焉。”可见肾脾二脏共司骨骼与肌肉作为人体运动的基础，互相补充，互相配合。另《素问·生气通天论》中云：“是故谨和五味，骨正筋柔，气血通畅，腠理致密，如是则骨气以精。”此句话表明了骨骼的强健有力除了源于骨骼本身，还需要腠理的保护、营养与支持，这是对骨骼和肌肉生理状态下的相互依存、相辅相成关系的生动阐释。中医学以肾主骨生髓，为先天之本，脾为后天之本，气血生化之源为根基，不断丰富脾肾理论，脾肾相资相助，使人体骨骼肌肉强健有力，骨髓不能濡养肌肉和骨骼，骨枯肉痿髓减，即“骨肉不相亲”的病机。而本文正是基于骨肉之间密不可分的关系来探讨肌源性干细胞(MDSCs)与成骨细胞之间分化的联系。

3.2 SDF-1与成骨分化

基质细胞衍生因子1(SDF-1)属于CXC类趋化因子亚家族，又被称趋化因子配体12(chemokine ligand 12，CXCL12)，是一种由骨髓基质细胞.分泌的细胞因子基质细胞衍生因子[6]。而SDF-1的两种亚型分别分为SDF -1α和SDF-1β，其中SDF-1α为此主要亚型[7]。SDF-1在人脑、肺、心脏、肠道等多种组织器官中均有表达，并且在血管内皮细胞、成骨细胞和成纤维细胞中也可以检测到SDF-1的存在[8]。有相关研究[9]表明，SDF-1通过诱导BMSCs上调骨形态发生蛋白(BMP)的表达，促进成骨分化，并增加局部血供。杨铠宁等[10]通过实验得出大鼠骨组织中SDF-1水平与骨质疏松大鼠骨骼发育存在密切关系的结论。更加印证了SDF-1与成骨分化存在密切联系。

3.3 肌源性干细胞向成骨细胞分化效应机制

肌源性干细胞(MDSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞[11]，可分化为成骨细胞[12]和软骨细胞[13]。有相关文献记载从小鼠体内分离得到MDSCs，并成功将其诱导为成骨细胞，李翔等[14]通过BMP-9诱导兔骨骼肌源性干细胞(MDSCs)成骨分化证实BMP-9对诱导MDSCs成骨分化具有较强的定向作用，以及梅晰凡等[15]将大鼠肌源性干细胞 (MDSCs)体外定向诱导为软骨细胞。以上实验全都印证了肌源性干细胞向成骨细胞分化的可行性。MDSCs是目前最有可能满足临床修复骨缺损要求的细胞，具有容易获取、来源广、短期内扩增量大的特点[12]，为临床骨质疏松症的治疗提供了思路。

目前，诱导成骨相关实验多数由骨髓间充质干细胞分化。然而对肌源性干细胞诱导成骨细胞分化的研究相对较少。刘颖等[16]在观察骨髓间充质干细胞成骨分化的过程中探讨朝藿定A对其分化的影响，应用ELISA技术研究其抗骨质疏松作用及相关分子机制；倪飞飞等[17]研究人骨髓间充质干细胞(hBMSC)受IL-18作用影响的成骨分化作用。以上皆是由骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验。

本研究结果显示，大鼠肌源性干细胞(MDSCs)在中医不同治法及方药作用下，经成骨诱导15 d后钙化结节的茜素红染色呈橘红色块状和片状，表明对钙化结节的形成有明显的促进作用。另从PCR和ELISA检测结果来看，不同治法均可以使成骨细胞中SDF-1蛋白表达水平升高，对肌源性干细胞(MDSCs)成骨分化存在正向促进作用，印证了肌源性干细胞成骨转化的可行性。中医基础理论“骨肉不相亲”对于肌源性干细胞成骨诱导具有指导意义，本研究也为中医临床治疗骨科疾病提供了科学的实验根据。