GCM1通过激活Wnt3a/β-catenin信号通路改善绝经后骨质疏松症

谢菲飞 宋立稳 王小英 胡燕芳 谢蕴云 刘文华 谢宝强*

1. 广东省人民医院赣州医院(赣州市立医院)内分泌代谢科，江西 赣州 341000

2. 潍坊市人民医院内分泌代谢科，山东 潍坊 261000

骨质疏松症是最常见的骨骼疾病之一，其特点是骨微结构发生改变、骨密度降低和脆性骨折风险增加[1]。据估计[2]，全球50岁以上人群中，约有40 %绝经后女性、20 %男性患有骨质疏松症。绝经后妇女的发病率要比同龄男性高6倍，其原因是绝经后卵巢功能衰退、雌激素水平下降，甲状旁腺素(PTH)导致骨吸收增强，成骨细胞的増殖和分化受到抑制，使骨吸收大于骨形成，从而导致骨密度降低，易发生骨折[3-4]。前期研究中发现GCM1在绝经后骨质疏松症(PMO)患者血清中低表达，但是关于GCM1在PMO中的作用和分子机制还尚未有研究报道。有研究发现GCM1能够促进星形胶质细胞和胚胎滋养层细胞的分化[5-6]，揭示其具有促进成骨细胞分化的潜力。本研究拟通过观察GCM1对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化的影响及具体的作用机制，为PMO的治疗提供新的思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)购自中国科学院基础医学研究所细胞资源中心；α-MEM培养基、胎牛血清(FBS)、TRIzolRNA分离试剂、逆转录试剂盒、SYBRGreen均购自ThermoFisherScientific(中国)；RIPA裂解缓冲液购自北京碧云天生物科技有限公司；碱性磷酸酶(ALP)染液购自南京建成生物工程研究所；GCM1兔多抗、GAPDH兔多抗购自proteintech；RUNX2兔单抗、Osterix兔单抗、Ostopontin兔单抗、CollagenI兔单抗、Wnt3a兔单抗、β-Catenin以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔免疫球蛋白IgG二抗均购自Abcam。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与分化：将MC3T3-E1细胞在含10 % FBS的α-MEM培养基中于37 ℃、含5 % CO2的条件下培养，当细胞密度达到80 %时，进行传代培养。细胞成骨分化培养：将MC3T3-E1细胞在分化培养基(DM)培养基中培养，并添加10 %胎牛血清、50 μg/mL抗坏血酸、4 mmol/L β-甘油磷酸酯和BMP2(300 ng/mL)，每三天更换一次，培养14 d[7]。

1.2.2细胞转染：GCM1过表达载体(pcDNA-GCM1)及其阴性对照(pcDNA-NC)和GCM1干扰序列(sh-GCM1)及其阴性对照(sh-NC)由广州锐博生物科技有限公司合成。根据脂质体LipofectamineTM2000制造商的使用说明书将GCM1过表达载体和GCM1干扰序列及其阴性对照转染至各自细胞组：Ov-NC组、Ov-GCM1组、Sh-NC组以及Sh-GCM1组，并通过qRT-PCR和Western blot检测转染效率。

1.2.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)定量分析：根据制造商的使用说明书，使用TRIzolRNA分离试剂从各组细胞中分离提取总RNA。通过逆转录试剂盒合成cDNA，使用SYBRGreen进行qRT-PCR定量分析。以GAPDH为内参进行归一化处理，并用2-ΔΔCt值计算目的基因相对表达水平。所用引物见表1。

表1 qRT-PCR的引物序列Table 1 The primer sequence of qRT-PCR

1.2.4蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测：将各处理组细胞以2×106个/孔接种在6孔板中，并在实验前培养24 h。收集转染后的各组细胞并在冰上用预冷的RIPA裂解缓冲液裂解10 min，收集总蛋白。通过BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量分析。取50 μg总蛋白使用SDS-PAGE在100 V条件下电泳1 h。随后，在60 V的条件下电转2 h将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室温下用5 %脱脂牛奶对膜封闭处理2 h，4 ℃下与一抗孵育过夜。将膜用含0.1 %Tween 20的PBS洗涤3次(每次10 min)在室温下和二抗一起孵育2 h。免疫印迹用增强的化学发光试剂(ECL)显色，并拍照观察。

1.2.5碱性磷酸酶(ALP)染色检测：在细胞成骨诱导14 d后，弃去培养皿中的诱导液，PBS洗涤3次，室温下在4 %多聚甲醛中固定30 min，弃去固定液，PBS洗涤3次。加入适量新鲜配置的底物应用液，在湿盒中避光孵育15 min后，水洗2 min。趁湿用复染液复染30 s，蒸馏水洗1 min，甩干，在倒置光学显微镜下拍照观察。

1.2.6茜素红染色：细胞诱导培养21 d后，弃去培养皿中的诱导液，PBS洗涤3次，在95 %乙醇中固定10 min，再用PBS洗1～2次，用含0.1 %茜素红溶液染色10 min。最后用PBS冲洗，在倒置光学显微镜下拍照观察。

1.3 统计学分析

所有实验均进行3次平行实验，并用GraphPad Prism8.0进行统计学分析，两组间比较采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05被认为差异具有统计学意义(双尾)。

2 结果

2.1 GCM1在PMO患者血清中低表达

在GEO数据库中获取并下载绝经后骨质疏松症患者芯片GSE56116数据(包括3例正常、10例PMO患者)，GEO2R分析发现GCM1在PMO患者血清中低表达(图1A)。如图1B、1C所示：Western Blot和qRT-PCR实验发现转染pcDNA-GCM1使MC3T3-E1细胞中GCM1表达升高(P<0.001)，而转染sh-GCM1后GCM1表达降低(P<0.001)。

2.2 GCM1促进BMP2诱导MC3T3-E1细胞成骨分化

RT-qPCR检测MC3T3-E1成骨分化过程中GCM1的相对表达情况，发现GCM1随着诱导成骨分化时间递增(图2A)。ALP是成骨分化的标志物，ALP染色实验发现(图2B)，和control组相比，BMP2诱导组ALP含量增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC组相比，BMP2+ov-GCM1组ALP含量增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC组比，BMP2+sh-GCM1组ALP含量降低(P<0.001)。进一步通过Western Blot检测成骨分化相关基因(RUNX2、Osterix、Ostopontin、CollagenⅠ)的表达水平，结果如图2C所示，和control组相比，BMP2诱导组成骨分化相关基因表达增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC组相比，BMP2+ov-GCM1组成骨分化相关基因表达增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC组比，BMP2+sh-GCM1组成骨分化相关基因表达降低(P<0.001)。RT-qPCR检测发现成骨分化相关基因mRNA表达水平与Western Blot结果保持一致(图2 D，P<0.001)，表明GCM1促进了BMP2诱导MC3T3-E1细胞成骨分化，而抑制GCM1表达则抑制了BMP2诱导MC3T3-E1细胞成骨分化。

2.3 GCM1促进MC3T3-E1细胞矿化

通过茜素红染色观察MC3T3-E1细胞矿化情况，结果如图3所示：和control组相比，BMP2诱导组成钙化结节面积增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC组相比，BMP2+ov-GCM1组钙化结节面积增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC组比，BMP2+sh-GCM1组钙化结节面积降低(P<0.001)。表明GCM1促进BMP2诱导MC3T3-E1细胞矿化，而抑制GCM1表达则抑制了BMP2诱导MC3T3-E1细胞矿化。

2.4 GCM1激活Wnt3a/β-catenin信号

通过Western Blot和RT-qPCR检测Wnt3a/β-catenin信号水平变化，结果如图4所示：和control组相比，BMP2诱导组GCM1、Wnt3a、β-catenin的表达水平增加(P均<0.001)；和BMP2+ov-NC组相比，BMP2+ov-GCM1组GCM1、Wnt3a、β-catenin的表达水平增加(P均<0.001)；和BMP2+sh-NC组比，BMP2+sh-GCM1组GCM1、Wnt3a、β-catenin的表达水平降低(P均<0.01)。表明GCM1在BMP2诱导MC3T3-E1细胞成骨分化过程中激活Wnt3a/β-catenin信号。

3 讨论

绝经后骨质疏松症(PMO)引起的疼痛和骨骼变形等症状均严重影响并困扰女性患者的生活及工作，带来的后果也给家庭和社会造成了负担，因此探究绝经后骨质疏松症的发生、发展机制并为PMO治疗提供新的思路具有重要意义。

GEO数据库包含全球各地研究者上传的各种高通量测序数据，在本研究筛选出的GSE56116芯片(包括3例正常、10例PMO患者)中，发现GCM1在绝经后骨质疏松症患者的血清中低表达。多项研究[8-9]发现GCM1能够促进胎盘滋养层细胞分化，但是关于其在绝经后骨质疏松症中的作用机制还尚未有研究报道。在骨质疏松症患者中增加骨形成，促进成骨细胞分化和矿化，促使骨形成大于骨吸收，能够有效缓解骨质疏松症[10]。本研究发现在诱导MC3T3-E1细胞成骨分化的过程中，GCM1表达逐渐增加，暗示GCM1与MC3T3-E1细胞成骨分化的进程相关。ALP是成骨细胞中的关键标记基因，在早期成骨中起关键作用，能够水解各类磷酸盐促进细胞成熟和钙化[11]。在成骨分化后期，转录因子RUNX2、Osterix促进细胞产生骨基质[12]，Ostopontin、Collagen Ⅰ在成骨分化过程中逐渐合成，促进细胞附着并刺激成骨细胞分化[13-14]。本研究通过ALP染色和Western Blot发现过表达GCM1能够促进ALP表达以及成骨相关蛋白的表达，而抑制GCM1表达则抑制了ALP表达以及成骨相关蛋白的表达。上述实验证实GCM1能够促进BMP2诱导MC3T3-E1细胞成骨分化。茜素红能够与钙发生显色反应，产生一种深红色的化合物，从而能够检测到成骨诱导的细胞外面沉积的钙化结节，进而用来鉴定细胞株的成骨分化[15]。本研究通过茜素红染色发现过表达GCM1促进MC3T3-E1细胞矿化，而抑制GCM1表达则抑制MC3T3-E1细胞矿化。

Wnt/b-catenin信号通路在调控胚胎发育、细胞增殖以及成骨分化和骨形成过程中发挥重要作用[16-18]。多项研究[19]发现激活Wnt/β-catenin信号通路能够促进细胞成骨分化，缓解骨质疏松症。如敲除Foxf1基因激活Wnt/β-catenin信号通路，促进骨髓间充质干细胞成骨分化，防止卵巢切除引起的骨丢失[20]；植物雌激素通过上调Wnt/β-catenin信号通路来预防去卵巢大鼠的骨质疏松症[21]。此外，还有研究[22]发现Preptin通过上调β-catenin表达促进MC3T3-E1细胞的增殖和成骨;熊果苷通过Wnt/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1小鼠成骨前体细胞增殖和分化[23]。脱盐鸭蛋蛋白肽通过上调Wnt3a表达，激活Wnt/beta-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化[24]。这些研究均表明激活Wnt/β-catenin信号通路在PMO的治疗中具有重要价值。本研究发现过表达GCM1可以上调Wnt3a、β-catenin的表达水平，而抑制GCM1表达则抑制了Wnt3a、β-catenin的表达，表明GCM1在MC3T3-E1成骨分化的过程中能够激活Wnt3a/β-catenin信号通路，暗示GCM1具有治疗PMO的潜在价值。

总之，本研究发现GCM1在PMO患者血清中低表达，过表达GCM1能够通过激活Wnt3a/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞的成骨分化和矿化，改善绝经后骨质疏松症，为PMO患者的治疗提供新的思路和治疗方向。