好氧混菌矿化能力与增强再生粗骨料性能研究

王玉珍， 孟庆玲， 许顺顺， 张家广*， 周爱娟

(1.太原理工大学土木工程学院， 太原 030024； 2.太原理工大学环境科学与工程学院， 太原 030024)

微生物矿化沉积方法(microbially induced carbonate precipitation;，MICP)利用自然界一些矿化微生物所具有的碳酸钙诱导沉积功能，沉淀物耐久性能良好且易附着胶结于砂浆和石子表面，可以有效的填充或黏结具有渗透性的有孔介质，从而实现改善材料的孔隙结构、修复混凝土材料微裂缝以及强化再生骨料等目的。MICP方法被越来越广泛用于建筑材料领域中，主要包括砖石类古建筑的修复[1]、土体加固[2]、修复污染土[3]、自修复混凝土裂缝[4]、增强再生骨料[5-6]等。目前适用于裂缝自修复混凝土和增强再生骨料的矿化微生物主要包括3种类型：①产脲酶微生物利用脲酶水解尿素产生碳酸根离子，与钙离子反应沉积碳酸钙；②好氧微生物通过新陈代谢的呼吸作用转化营养物质为碳酸钙；③硝酸盐还原菌的反硝化作用可以在缺氧环境下将有机碳转化成碳酸根离子，从而生成碳酸钙沉淀[7-9]。

目前学者针对MICP方法增强再生骨料物理力学性能进行了较多的试验研究。Grabiec等[10]验证了巴氏芽孢杆菌矿化沉积可以有效地降低再生骨料吸水率，MICP技术对再生骨料性能提高具有积极作用。朱亚光等[11]使用嗜碱芽孢杆菌H4和假坚强芽孢杆菌矿化改性再生骨料，嗜碱芽孢杆菌H4效果更好，矿化产物中碳酸钙含量更高，通过控制菌液浓度、温度、矿化时间可以有效提高矿化效率及再生骨料改性效果，且矿化系数、微生物自身矿化效果、对骨料矿化效果三者成正相关。Zhu等[12]基于好氧菌嗜碱芽孢杆菌H4诱导碳酸钙沉淀增强再生砂浆骨料，试验发现将骨料置于容器中部，并向含有细菌的培养液中添加氧气释放化合物，骨料浸泡20 d后其吸水率和破碎指数分别降低了40.38%和19.76%。Liu等[13]利用反硝化细菌对再生骨料改性进行试验，浸泡处理后再生骨料较原始骨料吸水率和压碎值分别降低14%和10%，表观密度提高4%。Liu等[14]采用巨大芽孢杆菌对透水混凝土中的再生粗骨料浸泡处理，骨料在含细菌和钙源及营养物质的培养基中浸泡21 d后，吸水率下降10.41%，制配的透水混凝土试块抗压强度提高28.48%。Zhan等[15]等通过巴氏芽孢杆菌强化再生细骨料，研究发现钙源不同对骨料的强化效果也不同，且氯化钙较硝酸钙效果更佳，处理后的再生细骨料吸水率和压碎值分别降低了40%和33%。Feng等[16]研究了pH、温度、细菌浓度和钙离子浓度对巴氏芽孢杆菌诱导沉淀量的影响，首先确定矿化条件，将再生细骨料浸泡于菌液与培养液的混合溶液中24 h，然后浸于沉淀培养液中，其吸水率降低，质量增加，且改性时间为7 d时最高效；在各类微生物中，产脲酶微生物矿化效率较高但水解尿素的过程中会释放氨气，因此对于好氧微生物等环境友好类的矿化微生物的研究也是十分必要的。此外，Qian等[17]研究了胶质芽孢杆菌的矿化，其固定空气中的二氧化碳产生碳酸盐和碳酸氢盐，进一步矿化用于水泥基材料的裂缝愈合，这种微生物也具备环境友好这一特性。微生物矿化沉积碳酸钙的过程受多种因素影响，提高微生物矿化效率满足环境友好和经济适用的要求有利于MICP技术更好地应用于实践中。

然而当前大多数学者所采用的矿化微生物为单一类型的微生物(纯菌)，纯菌矿化过程需要适宜的环境条件，抵御环境变化的鲁棒性可能不足，并且纯菌培养需要严格的无菌环境，其培养费用较高。与纯菌相比，多种矿化微生物组成的微生物群(混菌)对环境条件有更好的适应能力，其矿化效率更高，培养费用仅为纯菌的1/3左右[18-19]。

1 试验概况

1.1 混菌的筛选与培养

以山西省晋中市污水处理厂活性污泥和花园土壤为微生物源，在好氧条件下分别以乳酸、葡萄糖、蔗糖、木糖4种底物为碳源，制备不同的选择培养液，进行连续传代富集，好氧混菌的富集方法为：150 mL的锥形瓶中分别加入10 mL污泥混合液和100 mL好氧型选择培养液，用Na3PO4调pH至11，用耐高温组培封口膜覆盖瓶口，在33 ℃恒温振荡培养箱中培养2 d；后将上清液去除取下底部的污泥混合溶液在相同操作下进行连续传代富集，每隔一个周期(2 d)重复上述操作，直至筛选出目标菌群。混菌的矿化能力可由式(1)中的无机碳转化率(IC-CR)来表征，无机碳转化率越高则表明混菌的矿化能力越强。

(1)

式(1)中：ICt为时间t的无机碳浓度；IC0为选择培养液中的初始无机碳浓度；TOC0为选择培养液中的初始总有机碳浓度。

采用液体培养基对筛选的混菌进行大量培养，培养基配比为：每升超纯水中加入胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠10 g。菌液pH调节至7.0，在摇床中5 000 r/min转速下离心20 min得到菌泥，使用灭菌后的酵母浸粉溶液(5 g/L)重悬，获得一定OD600值的菌液。然后将菌液与营养液各50 mL加入150 mL的锥形瓶，置于恒温摇床，在温度为33 ℃，转速160 r/min的条件下进行微生物矿化反应，培养到一定时间后对瓶中液体进行离心，用超纯水将离心后的沉淀转移到烧杯中，最后放入105 ℃烘箱中烘干，称量沉淀物质量M，将其作为微生物矿化能力的评判标准。

1.2 不同环境条件下混菌矿化效率

为了考察不同环境条件对混菌矿化能力的影响，分别考察矿化时间、钙离子浓度、乳酸浓度、菌液浓度和不同钙源对混菌矿化效率的影响。并且在相同环境条件下将好氧嗜碱混菌矿化效率与好氧纯菌科氏芽孢杆菌进行对比，以考察混菌对比纯菌的矿化效率提升幅度。

1.2.1 矿化时间

分别采用表1所示的3组营养物质溶液，对混菌进行培养，培养时间设置为6～216 h，培养完成后对沉淀物进行离心和烘干处理，并称量其质量，以考察不同矿化时间对不同营养物质时的混菌矿化能力的影响规律。

表1 营养物质配比Table 1 Proportion of nutrients

1.2.2 钙离子浓度

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研究表明，随着钙离子浓度的逐步提高，微生物矿化效率呈现出先提高后降低的变化规律。为了考察钙离子浓度对混菌矿化效率的影响规律，以确定最优的钙离子浓度，设计6个试验组，钙离子浓度分别配制为0、5、25、45、65、85 g/L，乳酸浓度均为45 g/L,分别测试矿化时间为3 d和7 d时的沉淀物质量。

1.2.3 乳酸浓度

乳酸可作为混菌矿化的营养物质，保持钙离子浓度为65 g/L，将 UMB-2和UMB-3组的乳酸浓度分别配制为0、5、25、45、65、85 g/L，对混菌进行培养7 d，考察不同乳酸浓度对混菌矿化效率的影响，以确定出最优的乳酸浓度。

1.2.4 菌液浓度

为了考察不同菌液浓度对混菌矿化效率的影响，将菌液OD600值分别配制为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8，对混菌进行培养7 d。各测试组均采用测试得到的最优营养物质与钙离子浓度：UMB-1组乳酸钙浓度65 g/L；UMB-2组硝酸钙浓度65 g/L，乳酸浓度65 g/L；UMB-3组乳酸浓度45 g/L，硝酸钙浓度32.5 g/L，乳酸钙浓度32.5 g/L。

1.2.5 不同矿化微生物

将相同环境条件下好氧混菌与科氏芽胞杆菌的矿化效率进行对比，以考察混菌对比纯菌的矿化效率提升效果。设置2个测试组，其中AMB测试组矿化微生物采用本文筛选的好氧混菌，PBC测试组菌采用科氏芽孢杆菌。测试组的菌液OD600为1.0，营养物质配比为乳酸45 g/L，硝酸钙32.5 g/L，乳酸钙32.5 g/L，分别测试矿化时间为3 d和7 d时的沉淀物质量。

1.3 再生粗骨料矿化增强处理

采用最优配比参数的混菌和营养物质对再生骨料进行矿化增强处理，以验证本文筛选好氧混菌增强再生骨料物理力学性能的有效性。所采用的再生粗骨料购买自河北邯郸某再生骨料厂，粒径为5～20 mm。再生骨料矿化增强过程为：采用OD600=1.4的混菌溶液，用2 mol/L的NaOH溶液调节pH为9.0；再生骨料采用真空吸附法吸附混菌，即菌液在-0.06 MPa的气压下保持20 min吸附于再生粗骨料表面，5 d为一个周期共吸附两次，然后将吸附混菌的再生骨料在40 ℃环境下烘干至横重，最后放入玻璃器皿中加入65 g/L的乳酸钙溶液矿化增强处理一定时间后取出。为了保持增强处理过程中溶液氧气浓度恒定，采用氧气泵不间断向溶液中通入氧气，并且环境温度控制为33 ℃。增强处理完毕后，将再生骨料取出放入烘箱105 ℃烘干至恒重，并依据《建筑用卵石、碎石》(GB/T 14685—2011)分别测试不同增强时间下再生骨料的质量增加率、表观密度、吸水率和压碎指标。

2 试验结果与分析

2.1 混菌无机碳转化率

富集驯化完成后及时测试混菌的无机碳转化率和选择培养液pH。试验结果表明，筛选的好氧嗜碱混菌的无机碳转化率随着富集驯化次数的增加，表现出先升高后降低的变化趋势，最优富集驯化为12次。经富集驯化12次后，4种碳源对应的混菌IC转化率和选择培养液pH随时间的变化规律如图1所示。从图1中可以看出，以乳酸为碳源筛选的好氧嗜碱混菌无机碳转化率达到最高，是其他3组的1.52～2.08倍，且选择培养液pH随着时间延长降低幅度小于其他3组，其值从11降低至8.9，表明以乳酸为碳源富集驯化的混菌合成碳酸盐的能力最强。因此，选取以乳酸为碳源、经富集驯化12次后筛选的好氧混菌为矿化微生物。

图1 不同碳源下混菌的IC转化率和选择培养液pHFig.1 IC conversion rate of mixed cultures and pH value of culture solution using different substrate

2.2 矿化时间对混菌矿化效率的影响

不同营养物质下混菌经矿化反应7 d后生成的矿化沉淀物如图2所示，图2中的对照组仅采用营养物质溶液。从图2中可以看出，除对照组外各测试组经矿化反应7 d后瓶底均有沉淀物生成，表明本文筛选的好氧混菌具有良好的将钙源和营养物质转化为矿物沉淀能力。图3为UMB-1、UMB-2和UMB-3测试组在不同矿化时间下的混菌矿化沉淀量，从图3中可以看出，随着矿化沉积时间的延长，矿化沉淀量呈现出先逐渐增大后趋于稳定的变化规律；UMB-1组与UMB-3组在矿化沉积时间为6～72 h时，沉淀量增大幅度较小，超过72 h之后沉淀量增大幅度提高；UMB-2组随着矿化时间的延长，沉淀量呈现出线性增大趋势，使得一段时间后晶体质量趋于稳定；相同矿化时间下，UMB-2测试组的混菌矿化效率最高。此外，经168 h的矿化反应后，3个测试组的混菌矿化沉淀量均趋于稳定,原因可能为：随着矿化时间进一步延长，矿化沉淀物量大幅度增大，这些沉淀会逐渐把混菌包裹，致使与营养物质直接接触的混菌数量逐渐减少，从而导致混菌的矿化效率出现降低。

图2 不同营养物质下混菌的矿化沉淀物Fig.2 Mineralization ofmixed cultures using different nutrients

图3 矿化时间对混菌矿化效率的影响Fig.3 Effect of culture time on mineralization of mixed cultures

图4 钙离子浓度对混菌矿化效率的影响Fig.4 Effect of Ca2+ concentration on mineralization of mixed cultures

2.3 钙离子浓度对混菌矿化效率的影响

钙离子浓度对不同营养物质下混菌矿化沉淀量的影响如图4所示。从图4中可以看出，随着钙离子浓度逐渐增大，各测试组混菌沉淀量均呈现先增大后降低的趋势，当钙离子浓度为65 g/L时，3个测试组经3 d和7 d矿化反应的混菌沉淀量均达到最大，当钙离子浓度超过65 g/L时，各测试组矿化沉淀量均出现一定程度的下降；相同钙离子浓度下，UMB-3组的混菌矿化效率最高，3 d时和7 d时最大沉淀量分别达到1.01 g和1.2 g。上述试验结果表明，在一定范围内提高钙离子浓度能够有效提高混菌的矿化效率，但当钙离子超过一定浓度时，较高浓度的钙离子反而会抑制混菌的矿化效率，因此微生物矿化需选择合理的钙离子浓度。

2.4 乳酸浓度对混菌矿化效率的影响

图5 乳酸浓度对混菌矿化效率的影响Fig.5 Effect of lactic acid concentration on mineralization of mixed cultures

乳酸浓度对不同营养物质下混菌矿化效率的影响如图5所示，从图5中可以看出，随着乳酸浓度的增大，矿化沉淀量呈现出先增大后趋于稳定的变化规律；由于UMB-3组营养物质由乳酸和乳酸钙组成，其前期矿化反应速率较快，能够生成更多的矿化沉淀，其矿化效率比UMB-2更高；UMB-2和UMB-3组的最优乳酸浓度分别为65 g/L和45 g/L，相应的最大矿化沉淀量分别为0.94 g和1.2 g，菌液浓度一定时，混菌的分解营养物质的能力有限；当溶液中乳酸的浓度超过一定值时，混菌矿化沉积出的晶体质量趋于稳定，高浓度的乳酸不会明显抑制混菌的矿化反应。

2.5 菌液浓度对混菌沉积效率的影响

图6为菌液浓度对不同营养物质下混菌矿化效率的影响，从图6中可以看出，随着菌液OD600的增大，各测试组混菌的矿化沉淀量逐渐增大；相同菌液浓度下，UMB-3组混菌呈现出最高的矿化效率；当菌液OD600<0.2时，3个测试组混菌矿化效率均较快，当菌液OD600>0.2时，各测试组混菌矿化效率增长变缓。上述试验结果表明，菌液浓度越大，混菌的矿化效率越高。

图6 菌液浓度对营养物质矿化沉积量的影响Fig.6 The influence of bacterial liquid concentration on the amount of nutrient mineralization and deposition

2.6 不同矿化微生物矿化效率比较

矿化反应3 d和7 d时不同类型矿化微生物的矿化沉淀量如图7所示。从图7可以看出，PBC与AMB测试组矿化反应7 d时的沉淀量明显高于3 d沉淀量；相同矿化反应时间下，好氧嗜碱混菌的矿化沉淀量均显著大于科氏芽孢杆菌，矿化反应3 d和7 d时AMB组的矿化沉淀量分别为PBC组的1.11倍和1.08倍。上述试验结果表明，本文筛选的好氧混菌能够呈现出比好氧纯菌更强的矿化沉积能力。其原因可能为：与纯菌相比，混菌由不同菌落组成，其抗环境冲击能力更强，并且混菌的菌落之间能够相互交换代谢物或传递分子信号，使得混菌能够承担更多或者更复杂的任务，上述优势使得混菌的矿化鲁棒性更强，并且能够呈现出效率更高和稳定性更强的矿化沉积能力。

图7 不同矿化微生物矿化效率比较图Fig.7 Mineralization comparison of different bacteria

2.7 再生粗骨料的矿化增强效果分析

图8为不同混菌矿化增强时间对再生混凝土粗骨料物理力学性能的影响。从图8中可以看出，随着矿化增强时间的延长，再生骨料的质量增长率和表观密度逐渐提高；经过15 d矿化增强后，再生骨料的质量增长率达到2.5%，表观密度达到2 641 kg/m3，与未增强再生骨料相比提高了2.52%；随着矿化增强时间的延长，再生骨料的吸水率和压碎指标不断降低，当增强时间达到15 d时，再生骨料的吸水率和压碎指标达到最低值，分别为4.1%和11.2%，与未增强再生骨料相比降低幅度分别达到44.6%和30%。上述试验结果表明，筛选的混菌能够有效地修复再生粗骨料的表面缺陷，进而增强再生粗骨料的物理力学性能，延长混菌矿化增强时间能够显著地改善再生骨料物理力学性能增强效果。

图8 增强时间对再生粗骨料物理力学性能影响Fig.8 Effect of enhanced time on physical and mechanical properties of recycled aggregate

2.8 微观结构与物相分析

图9(a)为好氧混菌矿化沉淀物在放大3 000倍后的晶体扫描电子显微镜(SEM)微观图，从图9(a)中可以看出，混菌矿化沉淀物形状均为规则块状，由菱形状的晶体相互连接、相互结合成大的晶体团构成。图9(b)为经好氧混菌矿化增强后的再生粗骨料表面微观图，从图中可以看出，经过混菌矿化增强处理后的再生骨料表面生成一层碳酸钙沉淀，沉淀物较密实、均匀地附着在骨料表面，并且将旧砂浆与微裂缝有效包裹，在宏观角度表现为骨料的表观密度提高、吸水率与压碎指标降低等现象，从而实现增强再生骨料物理力学性能的目的。

图9 混菌矿化沉淀物和再生骨料表面SEM图Fig.9 SEM images of mixed cultures mineralization and surfaces of recycled aggregate

图10 混菌矿化沉淀物XRD分析图Fig.10 XRD analysis of mixed cultures mineralization

图10为混菌矿化增强再生骨料表面沉淀物的X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)图谱。从图10中可以看出，衍射谱在2θ=29.4°处出现了明显强峰，这与Herrington[20]得到的纯方解石强峰吻合良好，同时该矿化沉淀物其他峰值所对应的2θ与纯方解石型晶体的峰值有较高的匹配度。上述试验结果表明，混菌矿化增强再生粗骨料过程中生成的碳酸钙晶体类型为稳定的方解石。

3 结论

筛选了一种适用于增强再生混凝土骨料性能的好氧混菌，考察了不同环境因素对好氧混菌矿化效率影响规律及其对再生粗骨料物理力学性能增强效果，得到如下主要结论。

(1)相同环境条件下，筛选的好氧嗜碱混菌的矿化效果优于好氧纯菌，矿化反应7 d后混菌的沉淀量达到纯菌的1.08倍，其矿化沉淀物形状均为规则块状，由菱形状的晶体相互连接、相互结合成大的晶体团构成。

(2)不同环境因素对混菌矿化效应影响显著，随着矿化沉积时间的延长，矿化沉淀量呈现出先逐渐增大后趋于稳定的变化规律；菌液浓度越大，混菌的矿化效率越高；过高浓度的钙离子反而会抑制混菌的矿化效率。

(3)好氧混菌能够有效地增强再生粗骨料物理力学性能，矿化增强15 d后，沉淀物较密实、均匀地附着在骨料表面，并且将骨料表面旧砂浆与微裂缝有效包裹，再生粗骨料质量增长率和表观密度提高幅度分别达到2.9%和3.1%，吸水率和压碎指标分别降低44.6%和30%。