UPLC-Q-TOF-MS代谢组学探讨金天格胶囊防治骨质疏松症的机制

方颖琪 沈燚 张奇 王娜 刘玉玲 朱露林 张巧艳* 秦路平*

1. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州311053

2. 金花集团股份有限公司，陕西 西安710000

中药虎骨来源于动物虎 Panthera tigris L.的骨骼，具有补肾益精、强筋健骨、舒筋活血、祛寒止痛等作用，常用于治疗骨关节炎、类风湿关节炎和骨质疏松症[1]。化学和药理学研究[2]表明虎骨含有钙、磷等矿物质及氨基酸、多肽和蛋白质类成分，具有抗炎、镇痛、免疫调节和促进骨折愈合等作用。然而，按照濒危物种国际贸易公约(Convention on International Trade in Endangered Species，CITES)的要求, 虎Panthera tigris L.作为濒危动物应予以保护，我国于1993年禁止将虎骨作为药用[3]。人工虎骨粉由几种饲养的动物骨骼制备而成，与天然虎骨的化学成分相似，具有抗炎、镇痛、抗骨质疏松等药理作用[4]。金天格胶囊为人工虎骨粉的制剂，用于缓解腰背疼痛、腰膝酸软、下肢痿弱、步履艰难等症状，已被国家食品药品监督管理局批准(CFDA; China, Z20030080) 用于骨质疏松症和骨关节炎的防治[5]。临床试验[6]表明金天格胶囊单用或与其他药物联合应用可增加骨密度、缓解疼痛及降低化学药物的副作用。一项多中心、双盲、安慰剂对照的临床试验[7]证实金天格胶囊用于骨质疏松症防治具有良好的安全性和有效性。然而，金天格胶囊治疗骨质疏松症的机制尚不清楚。本研究以去卵巢大鼠为模型，应用UPLC-Q-TOF-MS技术分析大鼠血清代谢标志物的变化，以阐明金天格胶囊防治骨质疏松症的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

金天格胶囊(批号：210311-1)由金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂提供；其他试剂均为国药集团的分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1模型复制与实验方案：32只12周龄的雌性Wistar大鼠，由上海西普凯尔实验动物公司提供，饲养于浙江中医药大学实验动物中心饲养[许可证号：SYXK(浙)2018-0012]。饲养环境温度为(25±2) ℃，清洁级喂养，自由饮水及进食。动物实验严格遵守浙江中医药大学实验动物伦理委员会指导原则，禁食、禁水12 h后，每只大鼠经腹腔注射10 %的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，使其麻醉，按照国际公认的双侧卵巢摘除法进行绝经后骨质疏松大鼠模型复制[8]。切除卵巢后，第1天腹腔注射青霉素钠0.2 mL，随后每天注射0.1 mL青霉素钠，连续注射4 d。7 d后，按体重进行分组，包括假手术组，去卵巢模型组、金天格低剂量组(JTG-180 mg/kg)和金天格高剂量组(JTG-360 mg/kg)。从去卵巢手术后第8天开始灌胃给药，假手术对照组和模型组给予等量0.5 %的CMC-Na溶液，每天1次，给药12周。观察体重的变化，根据体重调整给药剂量。

1.2.2骨组织形态变化观察：取大鼠左侧后肢股骨，于4 %多聚甲醛中固定，常温保存，应用Micro-CT检测远端股骨的骨组织微结构，测定骨密度和骨矿含量。

1.2.3代谢组学分析

1.2.3.1血清样品制备：大鼠用10 %水合氯醛麻醉后，经腹主动脉取血，4 ℃下3 500 r/min离心15 min，分离血清。取50 μL血清，加入含内标(5 μg/mL L-氯苯丙氨酸)的150 μL甲醇，涡旋1 min。4 ℃下13 000 r/min离心15 min，取100 μL上清液置进样小瓶，用于代谢组学分析。取待测的血清样本各10 μL，混合，作为QC(quality control)样本。

1.2.3.2UPLC-MS分析：仪器：Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱与Agilent 6538 UHD 和 Accurate-Mass Q-TOF质谱联用仪。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®HSS T3(2.1 mm×100 mm, 2.5 μm)；流动相：A-0.1 %甲酸溶液，B-乙腈(0.1 %甲酸)；流速：0.35 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：正离子模式下2 μL，负离子模式下4 μL。梯度洗脱程序：0～2 min，5 % B；2～13 min，5%～95 % B; 13～15 min，95 % B。驻留时间为5 min。质谱参数：毛细管电压，阳离子模式为4 kV，阴离子模式为3.5 kV；干燥气体流速，11 L/min；气体温度350 ℃；载气压力，45 psig；碎裂电压，120 V；撇渣器电压，60 V；质谱的采集范围m/z 100～1 000。质谱采集过程中同时打入参比离子用于监测质量轴的准确性，正离子模式：121.050 9，922.009 8；负离子模式：112.985 6，1 033.988 1。

1.2.3.3数据处理和多变量数据分析：应用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00 software(Agilent Technologies, USA)将原始数据转换成通用(mz.data)格式，使用XCMS程序包进行峰的识别，保留时间校正，自动积分等预处理。按80 %原则对样本数量进行筛选后，接着内标归一化，得到一个包含样品名，m/z-RT对，峰面积的可视化矩阵。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件(版本14.1)，进行中心化和Pareto标度化后，进行多元统计分析。

1.2.3.4代谢途径分析：利用KEGG在线数据库(http：//www.genome.ad.jp/kegg/)、人代谢组数据库(HMDB, http://www.hmdb.ca/)、PubChem(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)和MetaboAnalyst(http://www.metaboanalyst.ca/)整合本研究中确定的潜在生物标志物，绘制代谢网络图。应用在线软件Statistical Analyst(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/ModuleView.xhtml)绘制差异代谢物热图。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 大鼠股骨Micro-CT分析

由图1可知，与假手术组(sham)比较，去卵巢组(OVX)大鼠的骨组织微结构退化，骨小梁稀疏，数量减少；与OVX组比较，180 mg/kg和360 mg/kg的金天格胶囊给药组大鼠的骨组织微结构恢复，骨小梁较为致密，数量显著增加。如表1所示，与sham组比较，OVX组大鼠的骨密度(bone mineral density，BMD)和骨矿物含量(bone mineral content，BMC)显著下降(P<0.01)，金天格胶囊给药组大鼠股骨的骨密度和骨矿物质含量显著增加(P<0.05，P<0.01)。

表1 大鼠远端股骨骨密度和骨矿物质含量

2.2 血清样品UHPLC-Q-TOF-MS代谢组学分析

在正离子和负离子模式下采用UHPLC-QTOF-MS扫描大鼠血清QC样品，得到总离子流(total ion chromatogram, TIC)，见图2。

图3所示，在主成分分析(PCA)评分图中，QC样品分布集中，表明数据质量较高，方法稳定性好。图3A、3B显示Sham组和OVX组大鼠血清样品在正负离子模式下的PCA得分图中能显著分离，表明去卵巢大鼠血清代谢轮廓发生了改变，映射了骨质疏松的发生与发展过程。图3C、3D显示在PCA得分图中，JTG-180 mg/kg组有接近一半的大鼠血清样品可与OVX组分离，JTG-360 mg/kg组的所有血清样品与OVX模型组可显著分离，表明金天格胶囊能够逆转去卵巢大鼠血清代谢轮廓的变化。

2.3 去卵巢大鼠骨质疏松症相关生物标志物的筛选

图4A、4B显示，Sham组和OVX组大鼠血清样品在有监督的OPLS-DA得分图中分离明显；图4C、4D显示，对血清样品的OPLS-DA得分图模型进行置换检验，得到Sham组和OVX组间正离子模式下的区分变量参数为 R2X=0.754，R2Y=0.999，预测Q2=0.897；负离子模式下的区分变量参数为R2X=0.481，R2Y=0.988，预测Q2=0.741。Q2数值较高，表明OPLS-DA模型可靠，未发生过拟合，可用于预测差异代谢物。通过S-plot散点图(图4E、4F)，结合VIP值(VIP>1)和t检验(P<0.05)筛选得到去卵巢大鼠骨质疏松症相关生物标志物。结合HMDB和KEGG 等在线数据库，最终鉴定出17个去卵巢大鼠骨质疏松症的生物标志物，见表2。

表2 大鼠血清中的代谢标志物Table 2 Metabolic markers in serum of rats

2.4 金天格胶囊对去卵巢骨质疏松症生物标志物的影响

将Sham组、OVX组和金天格胶囊处理组大鼠血清代谢物水平进行可视化热图分析，如图5A所示，与Sham组比较，OVX组大鼠血清中有15个生物标志物水平显著下调，2个显著上调；与OVX组比较，金天格胶囊处理组大鼠血清生物标志物大多显著回调，接近Sham组的水平。采用各组均值得到的可视化热图(图5B)也显示金天格胶囊能够逆转去卵巢诱导的骨质疏松症大鼠血清生物标志物的变化。

通过观察药物作用后血清生物标志物的回调个数及回调程度，可直观的反映金天格胶囊对去卵巢骨质疏松症大鼠的作用。如图6所示，与Sham组比较，去卵巢组大鼠血清中LysoPE(20∶0/0∶0)、L-色氨酸、半胱氨酸-丝氨酸、D-色氨酸、LysoPC(18∶1/0∶0)、5’-磷酸吡哆胺、LysoPC(20∶2/0∶0)、LysoPC(14∶0/0∶0)、LysoPC(18∶4/0∶0)、LysoPC(16∶1/0∶0)、15(S)-Hydroxyeicosatrienoic acid、N2-Succinyl-L-glutamic acid 5- semialdehyde、9-顺式视黄酸(9-cis-Retinoic acid)、甘氨胆酸(Glycocholic acid)和LysoPE(22∶6/0∶0)显著下调，PI(18∶0/20∶4)和5-HEPE显著上调。与OVX组比较，金天格胶囊处理组大鼠血清中LysoPE (20∶0/0∶0)、L-色氨酸、半胱氨酸-丝氨酸、D-色氨酸、LysoPC(18∶1/0∶0)、5’-磷酸吡哆胺、PI(18∶0/20∶4)和15(S)-Hydroxyeicosatrienoic acid的水平显著回调，其他代谢物的水平也有一定的回调趋势，提示金天格胶囊能够在一定程度上逆转OVX大鼠血清生物标志物的水平变化，发挥抗骨质疏松作用。

2.5 去卵巢骨质疏松症的相关代谢通路及金天格胶囊的调控作用

将表2中的17个差异代谢物导入metaboanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca)进行通路分析，如图7A所示，最终得到6条去卵巢骨质疏松症的潜在相关代谢通路，分别为色氨酸代谢、维生素B6代谢、视黄醇代谢、甘油磷脂代谢、原发性胆汁酸生物合成和氨基酰基-tRNA生物合成。将给予金天格胶囊后回调的8个代谢产物导入metaboanalyst 5.0进行通路分析，如图7B所示，得到4条金天格胶囊防治去卵巢大鼠骨质疏松症可能的代谢通路，分别为色氨酸代谢、维生素B6代谢、甘油磷脂代谢和氨基酰基-tRNA生物合成。利用KEGG数据库和MetaboAnalyst对各通路进行关联分析，得到代谢网络图(图7C)。

3 讨论

本研究利用去卵巢大鼠骨质疏松症模型，采用UPLC-Q-TOF-MS技术和多元统计分析方法，通过比较假手术组与模型组大鼠血清样品中的生物代谢物，发现了17种骨质疏松症相关的生物标志物及6条代谢通路。根据金天格胶囊对去卵巢骨质疏松症生物标志物的调控趋势，发现金天格胶囊可能通过调控维生素B6代谢和色氨酸代谢实现抗骨质疏松的机制。

维生素B6是机体正常生理活动所必须的营养物质[9]。低的维生素B6摄入水平或者血液中低的维生素B6浓度可能是骨质疏松潜在的风险因素。研究[10]表明血液中低浓度的维生素B6水平可导致破骨细胞的活性增强，骨基质的降解增加。骨折愈合过程中维生素B6缺失导致新骨的形成减少，及成骨细胞和破骨细胞的偶联失衡[11]。维生素B6缺失使得骨胶原的交联和形成减少，影响骨骼的机械力学性能，增加骨折风险[12]。维生素B6的代谢物包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺等[9]，金天格胶囊可在一定程度上逆转去卵巢大鼠血清5’-磷酸吡哆胺水平的降低，通过调节维生素B6代谢发挥抗骨质疏松作用。

色氨酸为人体必需氨基酸，通过犬尿氨酸通路进行代谢，并与骨骼的衰老、骨质降解、干细胞功能和骨生成有关[13]。色氨酸代谢物3-羟基犬尿氨酸、犬尿喹啉酸和氨茴酸会破坏骨骼，降低骨密度，增加骨折风险；而色氨酸其他代谢物如3-羟基氨茴酸、黄尿酸、吡啶甲酸和喹啉酸可增加骨密度[13-14]。犬尿氨酸的氧化产物可终止骨髓间充质干细胞的增殖，抑制成骨细胞的增殖、分化；同时犬尿氨酸水平增加会促进骨吸收，增强骨骼脆性，增加骨折风险[15]。金天格胶囊可逆转去卵巢大鼠血清色氨酸的降低，减少骨丢失。

甘油磷脂参与骨代谢的调控。大鼠去卵巢后血浆中甘油磷脂水平下降，抗骨质疏松药物能够逆转这一变化[8,16-17]。甘油磷脂水解后可生成溶血磷脂，其合成磷脂酸后再与碱基连接可形成磷脂酰乙醇胺。金天格胶囊可逆转去卵巢大鼠血清甘油磷脂代谢物溶血磷脂酰胆碱类成分及磷脂酰乙醇胺类成分水平的降低，调节骨代谢。

绝经后妇女血清胆汁酸水平与骨密度呈正相关，与反映骨吸收的骨转换生物标志物呈负相关[18]。胆汁酸影响维生素D的肠道吸收，进而影响维生素D对钙和磷酸盐代谢及骨矿化的调控作用[19]。本研究发现去卵巢大鼠血清中甘氨胆酸水平下降，导致胆汁酸转化异常，影响维生素D的吸收和骨代谢。

维生素A(视黄醇)是人体必需的维生素[20]，增加的血清视黄醇水平与低骨量和骨质疏松性骨折风险相关[21]。本研究发现去卵巢大鼠血浆中维生素A的降解产物9-顺维甲酸水平降低。金天格胶囊不能逆转卵巢大鼠血清甘氨胆酸和9-顺维甲酸水平，提示金天格可能不是通过调节胆汁酸和视黄醇代谢发挥抗骨质疏松作用的。

4 结论

本研究应用非靶向代谢组学的方法和思路，发现金天格胶囊通过调控维生素B6代谢和色氨酸代谢实现抗骨质疏松的作用机制，为其临床上用于骨质疏松症的防治提供了科学依据。后期有必要应用靶向代谢组学技术，深入探讨金天格胶囊对维生素B6和色氨酸代谢通路上代谢物变化的影响，进一步验证金天格胶囊调控骨代谢的作用机制。金天格胶囊对骨代谢的效应细胞成骨细胞和破骨细胞功能的调控作用也是后续应着力研究的方向。