番泻叶总黄酮的提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

张光辉，王晓驰，杨笑恺

(陕西中医药大学药学院，陕西 西安 712046)

番泻叶为豆科山扁豆属植物狭叶番泻或尖叶番泻的小叶，又称旃那叶、泻叶、泡竹叶，原产于干热地带，在我国台湾、广西、云南均有引种栽培。番泻叶味甘苦，具有泻热行滞、利水通便、止血、肌肉松弛与解痉等功效[1-2]。黄酮类化合物是番泻叶的活性成分之一，具有促进血液循环、降低胆固醇、改善心脑血管疾病、治疗肾病、降低血糖、抗疲劳、抗抑郁、抗骨质疏松、抗胃溃疡、预防癌症、调节免疫功能等药理作用[3-9]。此外，黄酮类化合物还具有抗氧化活性，可以有效清除体内的氧自由基，如花青素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种抗氧化作用可以阻止细胞退化、衰老[10-11]。番泻叶中黄酮类化合物含量可观，但国内外对番泻叶总黄酮的提取和抗氧化活性研究鲜有报道。鉴于此，作者在单因素实验的基础上，采用响应面法优化番泻叶总黄酮的提取工艺，通过测定其对DPPH自由基的清除率来评价其体外抗氧化活性，并对抗氧化实验进行方法学考察，拟为番泻叶总黄酮的开发利用提供一定的理论基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

番泻叶，市售，经陕西中医药大学中药鉴定教研室王纪涛高级实验师鉴定为豆科山扁豆属植物番泻叶。

芦丁标准品，北京索莱宝科技有限公司；DPPH自由基(2,2-联苯基-1-苦基肼基，纯度>98%)；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，分析纯。

DFY-500型摇摆式高速万能粉碎机，温岭林大机械有限公司；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山超声波仪器有限公司；TP-A200型电子天平，华志电子科技有限公司；UV-1780型紫外可见分光光度计，岛津仪器有限公司；HH-2A型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 芦丁标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准品10.0 mg，加入乙醇溶解并定容至50 mL，得0.20 mg·mL-1的芦丁标准溶液。移取芦丁标准溶液1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL、4.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入0.30 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min；然后加入0.30 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min；最后加入4.00 mL 1.0 mol·L-1氢氧化钠溶液，用乙醇定容到刻度，摇匀，静置15 min，显色；以乙醇为参比，测定510 nm处吸光度。以芦丁标准溶液浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程：A=10.802c+0.0113(R2=0.9995)。表明芦丁浓度在20～80 μg·L-1范围内与吸光度线性关系良好。

1.3 番泻叶总黄酮提取率的测定

将番泻叶置于80 ℃烘箱中干燥6 h，粉碎，过80目筛，装入塑封袋，保存。称取5.00 g番泻叶粉末置于烧杯中，按一定料液比加入乙醇，在一定温度下超声提取一定时间，提取液过滤，洗涤，滤液用乙醇定容至100 mL容量瓶中。移取2.50 mL提取液稀释液加入到50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度；再移取4.00 mL稀释液加入到10 mL容量瓶中，按1. 2方法显色，以空白为参比，测定510 nm处吸光度(A)。按式(1)计算番泻叶总黄酮提取率(%)：

(1)

1.4 番泻叶总黄酮提取工艺优化

采用单因素实验分别考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL，下同)、超声温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超声时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)对番泻叶总黄酮提取率的影响。在单因素实验的基础上，以超声时间、超声温度、料液比为考察因素，设计3因素3水平响应面实验，优化番泻叶总黄酮提取工艺。

1.5 番泻叶总黄酮体外抗氧化活性评价

精密称取DPPH自由基 0.010 0 g，加入乙醇超声溶解并定容至50 mL，得浓度为0.20 mg·mL-1的DPPH自由基溶液。在最佳条件下提取番泻叶总黄酮，提取液过滤，洗涤，滤液用95%乙醇定容至100 mL；再移取2.50 mL提取液稀释液，用95%乙醇定容至50 mL。移取4.00 mL上述样品溶液，加入1.50 mL 0.20 mg·mL-1DPPH自由基溶液，用95%乙醇定容至10 mL，静置一定时间后测定517 nm处[9-11]吸光度。按式(2)计算DPPH自由基清除率(%)：

(2)

式中：A1为4.00 mL样品溶液+1.50 mL DPPH自由基溶液+95%乙醇的吸光度；A2为4.00 mL样品溶液+95%乙醇的吸光度；A0为95%乙醇+1.50 mL DPPH自由基溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对番泻叶总黄酮提取率的影响(图1)

图1 料液比对番泻叶总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由图1可知，随着料液比的减小，即提取溶剂乙醇用量的增加，番泻叶总黄酮提取率先逐渐升高后缓慢下降，当料液比为1∶25时，总黄酮提取率最高。因此，选择1∶25作为响应面实验料液比的中心点。

2.1.2 超声温度对番泻叶总黄酮提取率的影响(图2)

图2 超声温度对番泻叶总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由图2可知，随着超声温度的升高，番泻叶总黄酮提取率先逐渐升高后缓慢下降，当超声温度为70 ℃时，总黄酮提取率最高。因此，选择70 ℃作为响应面实验超声温度的中心点。

2.1.3 超声时间对番泻叶总黄酮提取率的影响(图3)

图3 超声时间对番泻叶总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由图3可知，随着超声时间的延长，番泻叶总黄酮提取率先逐渐升高后缓慢下降，当超声时间为50 min时，总黄酮提取率最高。因此，选择50 min作为响应面实验超声时间的中心点。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计与结果(表1)

根据Design-Expert 8.0.6软件对表1数据进行拟合，得到二次多项式回归模型方程:Y=3.96-0.035A+8.955×10-3B+0.11C-0.10AB+0.092AC-0.19BC-0.35A2-0.22B2-0.15C2。

表1 响应面实验设计与结果Tab.1 Design and results of response surface methodologies

回归模型的方差分析见表2。

表2 方差分析Tab.2 Variance analysis

由表2可知，回归模型高度显著(P<0.001)，失拟项不显著，残差及纯误差的数值极小，说明回归模型的拟合度非常高，误差较小，未知因素的影响很小，该模型具有合理性。一次项A、C对番泻叶总黄酮提取率的影响高度显著，B的影响显著；交互项AB、AC、BC以及二次项A2、B2、C2对番泻叶总黄酮提取率的影响高度显著。各因素对番泻叶总黄酮提取率影响的大小顺序为：超声时间(A)>料液比(C)>超声温度(B)。

2.2.2 响应面分析

各因素交互作用对番泻叶总黄酮提取率影响的响应面图及等高线图如图4所示。

图4 各因素交互作用对番泻叶总黄酮提取率影响的响应面图及等高线图Fig.4 Response surface plot and contour plot for effect of interaction between various factors on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

响应面3D曲面越陡峭，则该因素对番泻叶总黄酮提取率的影响越大。由图4可知，超声时间对番泻叶总黄酮提取率的影响最大，其次是料液比，超声温度的影响最小；两因素交互作用均对总黄酮提取率的影响很大。对最佳工艺拟合方程求解，得到最佳提取工艺为：超声时间50.50 min、超声温度67.92 ℃、料液比1∶27.6，在此条件下，番泻叶总黄酮提取率的理论值为3.99%。

2.3 最佳工艺的验证

根据实际操作性，将最佳提取工艺调整为：超声时间50 min、超声温度68 ℃、料液比1∶28。准确称量番泻叶粉末5.00 g，在最佳提取条件下进行3次验证实验，得到番泻叶总黄酮平均提取率为3.94%，RSD值为0.54%，与理论值相差0.05%。说明响应面法优化得到的番泻叶总黄酮提取工艺准确可靠。

2.4 体外抗氧化活性评价

2.4.1 反应时间的确定

按1.5方法测定样品溶液与DPPH自由基溶液反应不同时间的吸光度，结果如图5所示。

图5 吸光度随反应时间的变化曲线Fig.5 Change curve of absorbance with reaction time

由图5可知，随着反应时间的延长，吸光度逐渐减小，当反应时间超过40 min后，吸光度趋于稳定，说明反应基本完全。因此，确定最佳反应时间为40 min。

2.4.2 对DPPH自由基的清除率

按1.5方法测定4.00 mL浓度为0.039 mg·mL-1样品溶液对DPPH自由基的清除率为60.5%，RSD值为0.26%(n=3)。说明番泻叶总黄酮提取液对DPPH自由基的清除能力较强。

2.4.3 样品溶液浓度对DPPH自由基清除率的影响(图6)

图6 样品溶液浓度对DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effect of sample solution concentration on scavenging rate of DPPH free radicals

由图6可知，样品溶液浓度越大，对DPPH自由基的清除率越高。

2.4.4 方法学考察

精密度：取4.00 mL浓度为0.039 mg·mL-1样品溶液，加入1.50 mL DPPH自由基溶液，按1.5方法连续测定5次吸光度，分别为0.461 7、0.461 6、0.461 6、0.461 7、0.461 7，RSD值为0.01%。表明仪器精密度较好，误差较小。

稳定性：取同一份样品溶液，显色后，每间隔2 min测定一次吸光度，共测定5次，测得吸光度分别为0.461 7、0.461 1、0.460 7、0.460 2、0.459 8，RSD值为0.16%。表明样品溶液在显色反应后有较高的稳定性。

重复性：取5份4.00 mL浓度为0.039 mg·mL-1样品溶液，分别加入1.50 mL DPPH自由基溶液，按1.5方法测得吸光度分别为0.461 7、0.463 4、0.460 4、0.461 1、0.462 4，RSD值为0.25%。表明该方法重复性良好。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用响应面法优化得到番泻叶总黄酮的最佳提取工艺为：超声时间50 min、超声温度68 ℃、料液比1∶28(g∶mL)，在此条件下，番泻叶总黄酮提取率为3.94%，RSD值为0.54%(n=3)，与理论值相差0.05%；番泻叶总黄酮具有较强的抗氧化活性，当番泻叶总黄酮浓度为0.039 mg·mL-1时，其对DPPH自由基的清除率为60.5%。