4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶的合成工艺改进

刘 波，向 建，向胤豪，周红艳，黄文胜，胡 盛

(湖北民族大学化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000)

4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶是多种激酶抑制剂，如组蛋白去乙酰化酶(HDAC)、丝裂原活化蛋白激酶作用激酶(MNK)[1]、表皮生长因子受体(EGFR)[2]等。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶同时抑制HDAC和MNK，可以增强对肿瘤细胞的抗增殖活性，为肿瘤治疗提供了新途径[3]；作为磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制剂[4-5]，对大鼠NPR-A的半数有效浓度EC50值达到10 nmol级，是一种新型强效NPR-A激动剂[6]。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶的前药和对映异构体亦具有很好的药学特性，具有较高的免疫抑制活性。4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶具有离子通道(如钙激活钾通道SK3)抑制特性，可制成药物制剂[4,7-10]，用于预防或治疗与衰老或压力相关的疾病、糖尿病、肥胖症、心血管疾病、凝血障碍、移植排斥反应、某些炎性疾病、神经退行性疾病、中枢神经系统TNF-α相关疾病、病毒性疾病(包括丙型肝炎)、勃起功能障碍、以过度或异常细胞增殖为特征的疾病(癌症)[5]、潮红、由线粒体活性增强引起的疾病或障碍等[11]。

4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)是4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶类药物的重要中间体，是MNK和莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合位点激酶(PIM)的双重抑制剂[12]，其细胞活性IC50值达到了个位数，具有重要的药物研究价值。目前，4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶的合成路线(图1)仅有一条：以2,6-二氯吡啶(Ⅰ)为起始原料，经硝化得到3-硝基-2,6-二氯吡啶(Ⅱ)，再经氰化亚铜亲核取代得到中间体2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶(Ⅲ)，经氰基水解、硝基还原得到3-氨基-6-氯吡啶甲酰胺(Ⅳ)，再经原甲酸三乙酯环合得到6-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮(Ⅴ)，最后经三氯氧磷氯代得到目标化合物4,6-二氯吡啶[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)。但该合成路线存在路线长、产率低、成本高等问题，限制了其广泛应用，为此，作者对该合成路线进行改进，并通过1HNMR、ESI-HRMS对中间体和目标化合物结构进行分析，以获得高产率质量稳定的4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶。

图1 4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶的合成路线Fig.1 Synthetic route of 4,6-dichloropyrido[3,2-d]pyrimidine

1 实验

1.1 试剂与仪器

石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇，天津富宇精细化工有限公司；甲醇、乙腈，色谱级，美国J.T.Baker公司；异丙醇、四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基苯胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、苄基三乙基氯化铵(TEBA)、氰化亚铜、浓硫酸、发烟硝酸、硝酸钾，市售；所用试剂均未经纯化直接使用。

SGW X-4型数字显微熔点仪(温度未经校正)，上海精密仪器有限公司；Agilent LC Core System高效液相色谱仪，色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；Bruker AVANCE Ⅲ(600 MHz)型核磁共振波谱仪，TMS为内标；Quattro micro API型三重四级杆串联质谱仪(1100 Series LC/MSD Trap)，ESI离子源(喷雾电压3.5 kV)，美国Agilent公司；ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.2 合成方法

1.2.1 3-硝基-2,6-二氯吡啶(Ⅱ)的合成

0 ℃搅拌下，将96%发烟硝酸(50 mL)滴加入装有98%浓硫酸(100 mL)的250 mL茄型瓶中，滴加完后保温搅拌30 min；将2,6-二氯吡啶(Ⅰ,15.0 g,102.0 mmol)分批加入到茄型瓶中，升温至95 ℃，于95～97 ℃保温反应6 h，TLC监测反应进程，展开剂石油醚-乙酸乙酯(10∶1，体积比，下同)，Rf=0.41；冷却至室温，倒入500 mL冰水中，冰浴下用30%氢氧化钠溶液调pH值至中性，析出大量淡黄色固体；抽滤，滤饼水洗(50 mL×3)，烘干，得17.0 g淡黄色固体化合物Ⅱ，不经纯化，直接投入下一步。

1.2.2 2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶(Ⅲ)的合成

室温(25℃)下，依次将NMP(150 mL)、TEBA(1.2 g,5.18 mmol)、化合物Ⅱ(10.0 g,52.0 mmol)加入到250 mL茄形瓶中，升温至190 ℃缓慢(5 min)加入氰化亚铜(13.9 g,0.156 mol)，保温反应70 min,TLC监测反应进程，展开剂石油醚-乙酸乙酯(5∶1)，Rf=0.25；趁热倒入乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液中，搅拌15 min，析出黄棕色固体；静置5 min待其分层，分离得乙酸乙酯层；水及固体层继续加入乙酸乙酯(250 mL×2)搅拌15 min，分离得乙酸乙酯层；合并乙酸乙酯层，依次用水、饱和氯化钠溶液各洗涤1遍，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得红棕色固体；用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重结晶，得6.0 g淡黄色固体化合物Ⅲ。

1.2.3 3-氨基-6-氯吡啶甲酰胺(Ⅳ)的合成

室温下，将无水乙醇(120 mL)、氯化亚锡(49.3 g,218.6 mmol)依次加入到250 mL茄形瓶中，搅拌溶解后缓慢(1 g·min-1)加入化合物Ⅲ(10.0 g,64.64 mmol)，室温反应30 min，TLC监测反应进程，展开剂石油醚-乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.33；蒸干溶剂使成糊状，用乙酸乙酯(1 000 mL)溶解，加入饱和碳酸氢钠溶液(100 mL)，随后用10%氢氧化钠溶液调pH值至7～8，析出大量白色固体；抽滤，将滤液分层，有机层依次用饱和碳酸氢钠溶液(800 mL)、水各洗涤1遍，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂得8.7 g黄色固体化合物Ⅳ，不经纯化，直接投入下一步。

1.2.4 6-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮(Ⅴ)的合成

室温下，将化合物Ⅳ(9.3 g,54.4 mmol)、冰乙酸(163 mg,2.72 mmol,0.16 mL)、原甲酸三乙酯(161.2 g,1.09 mol,167 mL)加入250 mL茄形瓶中，140 ℃反应4.5 h，TLC监测反应进程，展开剂二氯甲烷-甲醇(20∶1)，Rf=0.30；冷却至室温，析出大量固体；抽滤，将滤饼烘干，得9.2 g黄色固体化合物Ⅴ，不经纯化，直接投入下一步。

1.2.5 4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(Ⅵ)的合成

室温下，将化合物Ⅴ(5.0 g,27.47 mmol)、N,N-二甲基苯胺(5.0 g,41.21 mmol,5.2 mL)、乙腈(150 mL)、三氯氧磷(16.9 g,109.9 mmol,10.2 mL)依次加入250 mL茄形瓶中，82 ℃回流搅拌反应3.0 h，TLC监测反应进程，展开剂石油醚-乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.45；蒸干溶剂后用二氯甲烷(200 mL)溶解，饱和碳酸氢钠溶液调pH值至中性，静置分层，分离得有机层，水层用二氯甲烷(100 mL×2)萃取；合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和氯化钠溶液(200 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，蒸干溶剂得黑棕色固体；用300目硅胶作固定相，石油醚-乙酸乙酯(20∶1)作流动相，柱层析得4.5 g白色固体化合物Ⅵ。

2 结果与讨论

2.1 化合物的表征

化合物Ⅱ：产率85.3%。

化合物Ⅲ：产率63.4%，纯度99.59%，熔点106～108 ℃。1HNMR(600 MHz,DMSO-d6),δ:8.82(d,J=8.8 Hz,1H),8.18(d,J=8.8 Hz,1H)，与文献[13]报道一致。

化合物Ⅳ：产率93.7%，纯度96.21%。ESI-HRMS，m/z：172.025 8 [M+H]+。

化合物Ⅴ：产率93.4%，纯度98.96%。ESI-HRMS，m/z：182.011 3 [M+H]+。

化合物Ⅵ：产率82.7%，纯度96.90%。1HNMR(600 MHz,DMSO-d6),δ:8.23(s,1H),8.15(d,J=8.6 Hz,1H),7.89(d,J=8.6 Hz,1H)。

2.2 合成工艺的改进

2.2.1 化合物Ⅲ合成工艺的改进

采用原合成工艺，化合物Ⅲ的产率仅25.7%[14]，后处理时使用了大量的甲苯(对皮肤、黏膜有刺激性，对中枢神经系统有麻醉作用，且在体内不易代谢失活)，纯化时使用柱层析，使得反应不易放大、效率低，导致4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶价格昂贵。因此，有必要对反应溶剂、催化剂、投料比(氰化亚铜与化合物Ⅱ的用量比，以当量计)、反应温度、后处理方式等进行改进，以提高化合物Ⅲ的产率。

2.2.1.1 反应溶剂对化合物Ⅲ产率的影响

在化合物Ⅱ用量为2 g、投料比为2.0∶1的条件下，考察二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、NMP、THF等4种反应溶剂对化合物Ⅲ产率的影响，结果见表1。

表1 反应溶剂对化合物Ⅲ产率的影响Tab.1 Effect of reaction solvent on yield of compound Ⅲ

由表1可知，以DMSO、THF为反应溶剂时，未能获得化合物Ⅲ；以DMF为反应溶剂时，化合物Ⅲ产率较低；以NMP为反应溶剂时，化合物Ⅲ产率升至25.7%。

实验发现，当加入0.05 eq.TEBA相转移催化剂提高氰化亚铜在NMP中溶解度时，化合物Ⅲ产率由25.7%升至36.25%。

2.2.1.2 投料比对化合物Ⅲ产率的影响

以NMP为反应溶剂，加入0.05 eq.TEBA相转移催化剂，在化合物Ⅱ用量为2 g、反应温度为180 ℃的条件下，考察投料比对化合物Ⅲ产率的影响，结果见表2。

表2 投料比对化合物Ⅲ产率的影响Tab.2 Effect of molar ratio of materials on yield of compound Ⅲ

由表2可知，固定化合物Ⅱ用量，逐渐增加氰化亚铜用量，当投料比由1.5∶1增至4.0∶1时，化合物Ⅲ产率先升高后降低，在投料比为3.0∶1时产率达到最高，为47.3%。因此，将氰化亚铜用量由1.5 eq.调整为3.0 eq.。

2.2.1.3 反应温度对化合物Ⅲ产率的影响

以NMP为反应溶剂，加入0.05 eq.TEBA相转移催化剂，在化合物Ⅱ用量为2 g、投料比为3.0∶1的条件下，考察反应温度对化合物Ⅲ产率的影响，结果见表3。

表3 反应温度对化合物Ⅲ产率的影响Tab.3 Effect of reaction temperature on yield of compound Ⅲ

由表3可知，当反应温度为190 ℃时，化合物Ⅲ产率最高，达到63.4%。因此，将反应温度由原工艺的180 ℃提高到190 ℃。并且，在后处理中用乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液代替有毒的甲苯，用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重结晶代替柱层析进行纯化，使得后处理过程更简单方便，安全有效，便于工艺放大。

综上，确定化合物Ⅲ的合成工艺为：以NMP为反应溶剂、以0.05 eq.TEBA为相转移催化剂、氰化亚铜用量为3.0 eq.、反应温度为190 ℃、用乙酸乙酯-冰水(500 mL∶500 mL)混合溶液代替有毒的甲苯、用乙酸乙酯-石油醚(2∶5)重结晶代替柱层析进行纯化，化合物Ⅲ产率可提高到63.4%。

2.2.2 化合物Ⅵ合成工艺的改进

采用原合成工艺，化合物Ⅵ的产率仅42.3%，并且以毒害作用较大的三氯氧磷作反应溶剂，回流反应温度较高，反应剧烈不易控制。因此，有必要对氯代试剂、碱试剂及其用量、反应溶剂、回流反应温度等进行改进，以提高化合物Ⅵ的产率。

2.2.2.1 氯代试剂对化合物Ⅵ产率的影响

在0.5 eq.N,N-二甲基苯胺为碱试剂、化合物Ⅴ用量为1 g的条件下，分别以三氯氧磷、二氯亚砜为氯代试剂(用量3.0 eq.)合成化合物Ⅵ，结果见表4。

表4 氯代试剂对化合物Ⅵ产率的影响 Tab.4 Effect of chlorinated reagent on yield of compound Ⅵ

由表4可知，以二氯亚砜为氯代试剂时，不发生反应；以三氯氧磷为氯代试剂时，化合物Ⅵ产率达到42.3%。因此，选择三氯氧磷为氯代试剂。

2.2.2.2 碱试剂及其用量对化合物Ⅵ产率的影响

以三氯氧磷为氯代试剂，在化合物Ⅴ用量为1 g、反应温度为106 ℃的条件下，分别以N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、N,N-二甲基苯胺、DMF、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、三乙醇胺(TEA)、无机碱K2CO3作为碱试剂，使之与化合物Ⅴ的物质的量比为1∶0.5合成化合物Ⅵ，结果见表5。

表5 碱试剂对化合物Ⅵ产率的影响Tab.5 Effect of base reagent on yield of compound Ⅵ

由表5可知，以N,N-二甲基苯胺为碱试剂时，化合物Ⅵ产率最高。因此，选择碱试剂为N,N-二甲基苯胺。

在三氯氧磷为氯代试剂、化合物Ⅴ用量为1.0 eq.(1 g)、反应温度为106 ℃的条件下，逐渐增加碱试剂N,N-二甲基苯胺用量，考察碱试剂N,N-二甲基苯胺用量对化合物Ⅵ产率的影响，结果见表6。

表6 碱试剂N,N-二甲基苯胺用量对化合物Ⅵ产率的影响Tab.6 Effect of N,N-dimethylaniline dosage on yield of compound Ⅵ

由表6可知，随着碱试剂N,N-二甲基苯胺用量的增加，化合物Ⅵ产率逐渐升高。综合考虑，选择N,N-二甲基苯胺用量为1.5 eq.，此时化合物Ⅵ产率提高到83.6%。

2.2.2.3 反应溶剂对化合物Ⅵ产率的影响

为了避免三氯氧磷作为溶剂，在3.0 eq.三氯氧磷为氯代试剂、1.5 eq.N,N-二甲基苯胺为碱试剂、化合物Ⅴ用量为1 g的条件下，分别以1,4-二氧六环、DMF、乙腈、二氯甲烷、THF、甲苯、乙酸乙酯作为反应溶剂合成化合物Ⅵ，考察反应溶剂对化合物Ⅵ产率的影响，结果见表7。

表7 反应溶剂对化合物Ⅵ产率的影响Tab.7 Effect of reaction solvent on yield of compound Ⅵ

由表7可知，以乙腈为反应溶剂时，化合物Ⅵ产率最高，达到72.7%。

2.2.2.4 三氯氧磷用量对化合物Ⅵ产率的影响

以乙腈为反应溶剂，在三氯氧磷为氯代试剂、1.5 eq.N,N-二甲基苯胺为碱试剂、化合物Ⅴ用量为1 g、回流反应温度下合成化合物Ⅵ，考察三氯氧磷用量对化合物Ⅵ产率的影响，结果见表8。

表8 三氯氧磷用量对化合物Ⅵ产率的影响Tab.8 Effect of phosphorus oxychloride dosage on yield of compound Ⅵ

由表8可知，当三氯氧磷用量为4.0 eq.时，化合物Ⅵ产率达到82.7%。

将回流反应温度由108 ℃降为82 ℃，反应条件更温和，操作更安全。

综上，确定化合物Ⅵ的合成工艺为：以1.5 eq.N,N-二甲基苯胺作为碱试剂、以乙腈作为反应溶剂、回流反应温度为82 ℃，化合物Ⅵ产率可提高到82.7%。

3 结论

以2,6-二氯吡啶为起始原料，经硝化、亲核取代、氰基水解、硝基还原、环合、氯代得到化合物4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶。在中间体2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶的合成过程中，将反应温度由180 ℃提高到190 ℃，氰化亚铜用量由1.5 eq.调整为3.0 eq.，同时加入苄基三乙基氯化铵作为相转移催化剂改善氰化亚铜的溶解性，后处理以乙酸乙酯-冰水混合溶液代替甲苯，并且用重结晶法代替柱层析法进行纯化，2-氰基-3-硝基-6-氯吡啶的产率由25.7%提高到63.4%。在最后一步氯代过程中，以1.5 eq.N,N-二甲基苯胺作为碱试剂、用乙腈代替三氯氧磷作反应溶剂、回流反应温度为82 ℃，避免了三氯氧磷的毒性危险，使得反应更温和稳定，产率由42.3%提高到82.7%。通过对上面两步反应条件的改进，4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶总产率从8.1%提高到39.1%，该结果对4,6-二取代吡啶并[3,2-d]嘧啶类化合物的合成工艺研究具有重要价值。