一种ICT型荧光探针的光谱性质与识别机制研究

成 昭，郑 蕾，徐 玥，何 昊

(西安医学院药学院，陕西 西安 710021)

过渡金属Zn、Cu、Hg广泛参与代谢、信号转导等生理过程，与生命体中氧化还原过程密切相关。研究Zn、Cu、Hg的分布、转运与动态浓度变化，能够为神经生理学与神经病理学提供重要信息。其中，Zn与认知活跃度的相关性较高[1-2]，其最大浓度分布出现于脑部；Cu具有两种主要氧化态Cu+、Cu2+，存在于生命体中多种氧化还原路径，Cu的异常积累已被证明参与了多种神经退行性疾病的致病机制[3-4]；此外，空气、土壤、水体中过量分布的Cu和Hg不仅影响生态环境，还会通过食物链富集，经食源性摄入后危及人体健康。因此，有必要对环境中Zn2+、Cu2+、Hg2+进行定性定量检测[5]。

使用小分子荧光探针进行目标物的识别与检测时，能够将探针-目标物分子水平的识别作用转化为可调控的荧光信号，识别过程响应迅速、直观可视。此外，荧光探针还具有检测方法简单、试样用量少、检出限低、线性响应等优势[6-7]。因此，作者基于分子内电荷转移(intramolecular charge transfer，ICT)机制进行探针结构设计[8-9]，引入多羧酸配体作为识别基团，以苯乙烯类发色团苯并咪唑作为荧光基团，合成得到乙酸甲酯型荧光探针S13，通过1HNMR、IR、MS对中间体及S13进行表征；然后对S13进行水解得到其Cs盐形式T13，并将T13用于水环境中金属离子(Zn2+、Cu2+、Hg2+)的识别，通过分析荧光强度与Zn2+、Cu2+、Hg2+浓度的线性关系，研究探针T13的光谱性质，并初步探究探针T13对Zn2+、Cu2+、Hg2+的识别机制。

1 实验

1.1 试剂与仪器

4-甲基-2-硝基苯酚、1-溴-2-氯乙烷、溴乙酸甲酯、邻苯二胺等均为市售化学纯，未经纯化直接使用。

XT-4型显微熔点仪，北京泰克科技有限公司；TENSOR T-27型红外分光光度计、AVANCE Ⅲ 400MHz型超导核磁共振波谱仪、microTOF-QⅡ ESI-Q-TOF LC/MS/MS型飞行时间质谱仪，美国布鲁克科技有限公司；UV-1700型紫外分光光度计，日本岛津制作所；LS-55型荧光分光光度计，美国铂金埃尔默仪器有限公司。

1.2 探针S13的合成

以4-甲基-2-硝基苯酚、1-溴-2-氯乙烷、溴乙酸甲酯、邻苯二胺等为原料，经6步反应得到一种ICT型荧光探针S13，其合成路线如图1所示。

图1 探针S13的合成路线Fig.1 Synthetic route of probe S13

1.2.1 3-硝基-4-(2-氯乙氧基)甲苯(Ⅰ)的合成

将4-甲基-2-硝基苯酚(1.53 g，0.01 mol)、1-溴-2-氯乙烷(4.30 g，0.03 mol)与无水碳酸钾(2.07 g，0.015 mol)均匀混合于DMF(8 mL)中，120 ℃反应5 h；冷却，加入20 mL乙酸乙酯，水洗(10 mL)3次，蒸干溶剂，用甲醇-水重结晶，得到化合物Ⅰ。

1.2.2 1-(4-甲基-2-硝基苯氧基)-2-(5-甲基-2-硝基苯氧基)乙烷(Ⅱ)的合成

将化合物Ⅰ(2.15 g,0.01 mol)、5-甲基-2-硝基苯酚(1.53 g,0.01 mol)与无水碳酸钾(2.50 g,0.018 mol)均匀混合于DMF(10 mL)中，140 ℃反应 4 h；冷却，将反应混合物倒入20 mL冰水中，抽滤，水洗(10 mL)3次，用甲醇-水重结晶，得到化合物Ⅱ。

1.2.3 1-(4-甲基-2-氨基苯氧基)-2-(5-甲基-2-氨基苯氧基)乙烷(Ⅲ)的合成

将浓盐酸(0.2 mL)与无水乙醇(10 mL)均匀混合，向其中加入还原铁粉(3.36 g,0.06 mol)，80 ℃反应30 min，使铁粉充分活化；再向其中分批加入化合物Ⅱ(3.32 g,0.01 mol)，80 ℃反应4 h；反应结束，用15%KOH-乙醇调节反应混合物pH值为7～8，过滤去除铁粉；滤液中加入6 mol·L-1硫酸，析出白色硫酸盐沉淀，过滤；沉淀溶于60 ℃热水，用饱和氢氧化钠溶液调节pH值为9～10，冷却，抽滤，用甲醇重结晶，得到化合物Ⅲ。

1.2.4 2-[2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基]-5-甲基苯胺-N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(Ⅳ)的合成

将化合物Ⅲ(2.72 g,0.01 mol)与MeCN(10 mL)均匀混合，加入二异丙基乙胺(6 mL,0.05 mol)和溴乙酸甲酯(3 mL,0.05 mol)，80 ℃反应12 h；冷却，加入20 mL乙酸乙酯，抽滤去除固体，旋干滤液，得到黄色油状物；加入少量甲醇，室温搅拌4～6 h；抽滤，所得固体以甲醇重结晶，得到化合物Ⅳ。

1.2.5 2-[2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基]-4-甲酰基-5-甲基苯胺-N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(Ⅴ)的合成

控制温度为5～10 ℃，于40～45 min内向DMF(20 mL)中缓慢滴加POCl3(2.4 mL)，室温下搅拌所得POCl3/DMF混合物2 h，使之混合均匀；加入化合物Ⅳ(5.60 g,0.01 mol)的DMF(20 mL)溶液，75 ℃反应4 h；冷却，倒入100 mL冰水中，抽滤所得固体粗品以体积比1∶1的乙酸乙酯-正己烷为洗脱剂进行柱分离，得到化合物Ⅴ。

1.2.6 2-[2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基-5-甲基苯胺-N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(探针S13)的合成

将化合物Ⅴ(0.59 g,1 mmol)与邻苯二胺(0.11 g,1 mmol)均匀混合于无水乙醇(10 mL)中， 80 ℃反应4 h；冷却，旋干溶剂，得到固体粗品，以体积比1∶1的乙酸乙酯-正己烷为洗脱剂进行柱分离，得到探针S13。

1.3 探针T13的合成

研究探针的光谱性质时，需将乙酸甲酯型荧光探针S13水解为Cs盐形式的荧光探针T13，使探针识别基团的多羧酸识别位点能够快速识别目标物，给出即时荧光响应，同时，进一步提高探针水溶性。

分析天平准确称取S13(C35H40N4O10)0.067 7 g(0.1 mmol)、CsOH·H2O 0.167 9 g(1 mmol)，加入10 mL无水乙醇，搅拌回流，反应过夜；待反应结束后，冷却至室温，真空旋干溶剂，得到探针T13。

1.4 探针T13对金属离子的选择性

选择一价碱金属(Na+)、二价碱土金属(Mg2+、Ca2+、Ba2+)、过渡金属(Fe3+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Ag+)及Sn2+、Al3+等13种常见金属离子，进行探针T13对金属离子选择性考察实验。取14支10 mL比色管，编号；1#为对照，仅加入探针T13；2#～14#分别加入Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Na+、Sn2+、Zn2+及Tris-HCl(pH值7.4)、探针T13，使T13与金属离子的终浓度均为1×10-5mol·L-1。混合均匀，进行350～550 nm荧光光谱扫描，进一步分析各谱线在397 nm处的最大荧光强度，研究探针T13对金属离子的选择性。

1.5 探针T13的光谱性质

于一系列10 mL比色管中，分别加入探针T13溶液与浓度依次递增的Zn2+/Cu2+/Hg2+溶液，使T13终浓度为10 μmol·L-1，Zn2+/Hg2+终浓度(μmol·L-1)分别为0、2、4、8、16、30、40、80、150、300、500、800、1 000，Cu2+终浓度(μmol·L-1)分别为0、2、4、8、16、30、40、80、150、300、500，混合均匀，进行350～550 nm荧光光谱扫描，通过分析荧光强度与Zn2+/Cu2+/Hg2+浓度的线性关系，研究探针T13的光谱性质。

保持探针T13与Zn2+的总浓度为10 μmol·L-1，于11支10 mL比色管中分别加入体积依次递增的Zn2+溶液和体积依次递减的探针T13溶液，使Zn2+的物质的量分数分别为0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，通过分析荧光强度与Zn2+的物质的量分数的关系，得到探针T13与Zn2+的络合比；进一步分析T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+体系397 nm处荧光强度峰值与金属离子浓度的关系，确定探针T13与Zn2+/Cu2+/Hg2+的络合比。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

化合物Ⅰ：淡黄色针状结晶，产率90%，熔点32～34 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:7.66(s,1H,Ar-H),7.34(d,J=8.2 Hz,1H,Ar-H),6.99(d,J=8.6 Hz,1H,Ar-H),4.36(t,J=3.0 Hz,2H,-CH2O-),3.76(t,J=3.2 Hz,2H,-CH2Cl),2.36(s,3H,-CH3);IR(KBr压片),ν,cm-1:2 930.32(C-H),1 530.26(-NO2),1 357.37(-NO2),1 258.09(C-O-C),1 157.78(C-O),1 030.57(C-O),810.71(=C-H)。

化合物Ⅱ：黄色针状结晶，产率93%，熔点148～150 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:7.79(d,J=8.2 Hz,1H,Ar-H),7.64(s,1H,Ar-H),7.27(d,J=8.6 Hz,2H,Ar-H),7.03(s,1H,Ar-H),6.87(d,J=8.3 Hz,1H,Ar-H),4.50(s,4H,-OCH2CH2O-),2.44(s,3H,-CH3),2.36(s,3H,-CH3);IR(KBr压片),ν,cm-1:2 930.87(C-H),1 602.88(C=C),1 521.12(-NO2),1 349.06(-NO2),1 253.53(C-O-C),1 172.98(C-O),1 057.85(C-O),814.56(=C-H)。

化合物Ⅲ：白色粉末，产率91%，熔点116～119 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:6.77(d,J=8.2 Hz,2H,Ar-H),6.71(s,1H,Ar-H),6.69(s,1H,Ar-H),6.65(d,J=8.6 Hz,2H,Ar-H),4.35(s,4H,-OCH2CH2O-),3.82(s,4H,2×-NH2),2.36(s,3H,-CH3),2.26(s,3H,-CH3);IR(KBr压片),ν,cm-1:3 440.95(N-H),2 928.22(C-H),1 624.65(C=C),1 517.88(C=C),1 227.23(C-O),1 157.32(C-O),801.09(=C-H),674.64(=C-H)。

化合物Ⅳ：白色粉末，产率82%，熔点92～95 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:8.03(s,1H,Ar-H),6.81(d,J=8.2 Hz,1H,Ar-H),6.76(s,1H,Ar-H),6.68(s,4H,Ar-H),4.37(s,4H,-OCH2CH2O-),4.15(s,4H,2×-CH2-),4.05(s,4H,2×-CH2-),3.57(s,12H,4×-CH3),2.33(s,3H,-CH3),2.26(s,3H,-CH3);IR(KBr压片),ν,cm-1:2 953.88(C-H),1 751.26(C=O),1 518.92(C=C),1 255.06(C-O),1 170.72(C-O),795.78(=C-H),710.89(=C-H)。

化合物Ⅴ：淡黄色粉末，产率75%，熔点109～112 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:10.13(s,1H,-CHO),7.32(s,1H,Ar-H),6.79(d,J=8.2 Hz,1H,Ar-H),6.69(s,1H,Ar-H),6.67(d,J=8.8 Hz,1H,Ar-H),6.45(s,1H,Ar-H),4.30～4.29(m,4H,-OCH2CH2O-),4.26～4.23(m,4H,2×-CH2COO-),4.15(s,4H,2×-CH2-),3.62(s,12H,4×-CH3),2.56(s,3H,-CH3),2.27(s,3H,-CH3);IR(KBr压片),ν,cm-1:3 015.76(=C-H),2 952.21(C-H),2 923.21(C-H),1 749.40(OC=O),1 681.47(HC=O),1 601.23(C=C),1 520.54(C=C),1 257.98(C-O),1 201.54(C-O),1 167.63(C-O),711.38(=C-H);ESI-HRMS,m/z:611.221 5(calcd.for C29H36N2O11:588.231 4,[M+Na]+calcd.:611.221 1,[M+Na]+found:611.221 5)。

探针S13：白色固体，产率76%，熔点136～137 ℃。1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:7.60(dd,J=5.9 Hz、3.1 Hz,2H,Ar-H),7.27(dd,J=6.6 Hz、3.7 Hz,3H,Ar-H),6.78(s,1H,Ar-H),6.71～6.64(m,3H,Ar-H),4.32(s,1H,-NH-),4.21(s,4H,2×-CH2-),4.08(s,4H,2×-CH2-),3.56(s,6H,2×-CH3),3.53(s,6H,2×-CH3),2.99(s,2H,-OCH2-),2.86(s,2H,-OCH2-),2.45(s,3H,-CH3),2.25(s,3H,-CH3);IR(KBr压片),ν,cm-1:3 440.91(N-H),2 951.28(C-H),1 745.16(C=O),1 608.17(C=C),1 514.42(C=C),1 480.53(C=C),1 170.25(C-O),751.84(=C-H),710.97(=C-H);ESI-HRMS,m/z:677.281 0(calcd.for C35H40N4O10:676.273 9,[M+H]+calcd.:677.281 7,[M+H]+found:677.281 2)。

化合物Ⅰ～Ⅴ的1HNMR、IR数据均与预期结构相符，经合成引入的官能团羰基、醚键等均呈现其特征吸收，特征氢位移均能由1HNMR进行归属。探针S13的1HNMR、IR、MS数据符合预期设计，可以进行进一步的光谱性质分析。

2.2 光谱性质分析

2.2.1 探针S13的荧光激发与发射光谱

配制浓度为1×10-5mol·L-1的探针S13溶液，进行200～500 nm荧光光谱扫描，结果如图2所示。

图2 探针S13的荧光激发与发射光谱Fig.2 Fluorescence excitation and emission spectra of probe S13

从图2可以看出，探针S13荧光激发与发射谱峰的镜像对称关系良好[9](λex=315 nm，λem=397 nm)，斯托克位移为82 nm。

2.2.2 探针T13对金属离子的选择性(图3)

图3 探针T13对金属离子的选择性Fig.3 Selectivity of probe T13 towards metal ion

从图3可以看出，探针T13对Cu2+、Hg2+表现出猝灭型荧光响应，对Zn2+表现出增强型荧光响应，其它金属离子未引起探针T13荧光强度的明显变化。说明探针T13对Zn2+、Cu2+、Hg2+具有选择性响应，能够进一步用于水环境中Zn2+、Cu2+、Hg2+的选择性识别与荧光标记。

2.2.3 探针T13与Zn2+/Cu2+/Hg2+的线性关系

T13-Zn2+、T13-Cu2+、T13-Hg2+溶液的荧光光谱如图4所示。

图4 T13-Zn2+、T13-Cu2+、T13-Hg2+溶液的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of T13-Zn2+,T13-Cu2+,and T13-Hg2+ solutions

从图4可以看出，探针T13的荧光强度随着Zn2+浓度的增加逐渐增强，随着Cu2+/Hg2+浓度的增加逐渐减弱。

对T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+体系397 nm处荧光强度(y)与Zn2+/Cu2+/Hg2+浓度(x)进行线性相关性分析[10]，结果如图5所示。

图5 T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+体系荧光强度与Zn2+/Cu2+/Hg2+浓度的线性关系Fig.5 Linear relationships of fluorescence intensity of T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+ with concentration of Zn2+/Cu2+/Hg2+

从图5可以看出，T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+体系荧光强度与Zn2+/Cu2+/Hg2+浓度的线性关系分别为：T13-Zn2+(0～8 μmol·L-1)，y=164.79x+1325(R2=0.9970)；T13-Cu2+(0～16 μmol·L-1)，y=-146.64x+5036.6(R2=0.9963)；T13-Hg2+(0～8 μmol·L-1)，y=-514.79x+6033(R2=0.9992)。表明，当Zn2+/Cu2+/Hg2+浓度处于μmol·L-1数量级时，探针T13的荧光强度与Zn2+/Cu2+/Hg2+浓度之间具有良好的线性关系，能够进行Zn2+/Cu2+/Hg2+的准确定量分析，初步满足μmol·L-1数量级的生理浓度检测要求。

2.2.4 探针T13与Zn2+/Cu2+/Hg2+的络合比

T13-Zn2+溶液397 nm处荧光强度与Zn2+的物质的量分数之间的Job’s曲线如图6所示。

图6 T13-Zn2+溶液397 nm处荧光强度与Zn2+物质的量分数的Job’s曲线Fig.6 Job’s plot of fluorescence intensity at 397 nm of T13-Zn2+ solution with molar fraction of Zn2+

从图6可以看出，对于T13-Zn2+的荧光增强型响应，当Zn2+的物质的量分数为50%时，T13-Zn2+溶液在397 nm处荧光强度出现最大值。表明，T13-Zn2+络合物具有最大浓度，其定量结合比为1∶1。 为了进一步分析探针T13与Zn2+/Cu2+/Hg2+的络合比，绘制T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+、T13-Hg2+溶液397 nm处荧光强度峰值与Zn2+/Cu2+/Hg2+浓度的关系曲线，结果如图7所示。

图7 T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+溶液397 nm处荧光强度峰值与Zn2+/Cu2+/Hg2+浓度的关系曲线Fig.7 Relationship between peak value of fluorescence intensity at 397 nm of T13-Zn2+/Cu2+/Hg2+ solutions with concentration of Zn2+/Cu2+/Hg2+

从图7可以看出，探针T13对Zn2+表现出特异性荧光增强响应，探针T13与Zn2+的定量结合比为1∶1，与图6结论相似。探针T13对Cu2+、Hg2+表现出荧光猝灭响应，当Cu2+/Hg2+浓度较小时，探针T13的荧光不完全猝灭；当探针T13与Cu2+/Hg2+物质的量相同或Cu2+/Hg2+浓度较大时，荧光完全猝灭或荧光强度不再变化，表明探针T13与Cu2+/Hg2+的定量结合比为1∶1。

2.3 识别机制探究

离子识别实验表明，探针T13对Zn2+表现特异性荧光增强响应，对Cu2+、Hg2+表现荧光猝灭响应；而S13、T13、T13-金属离子的紫外吸收光谱(图8)表明，T13、T13-金属离子的紫外吸收光谱无明显差别。

图8 S13、T13、T13-金属离子的紫外吸收光谱Fig.8 UV absorption spectra of S13,T13,and T13-metal ions

探针T13识别Zn2+、Cu2+、Hg2+的方式主要由两方面因素决定：一方面，依据分子识别的ICT机制[11-12]，T13分子内同时具有电子给体和电子受体，且其分子结构中的荧光基团与识别基团直接相连。当识别基团与目标物Zn2+、Cu2+、Hg2+结合时，首先影响分子内的推-拉电子作用，进而诱使分子内电荷转移过程随之减弱或强化[13](图9)，从而导致荧光光谱的变化。而当T13-金属离子识别作用中的电荷转移变化引起其荧光发射信号变化时，分子吸收则几乎不受影响，反映为紫外吸收光谱几乎无改变。另一方面，探针T13识别部分的氮原子具有孤对电子、表现给电子作用，而分子中的不饱和环则作为电子受体，分子内电荷转移路径发生于电子给体至电子受体，使探针分子呈现荧光。结合目标物Zn2+、Cu2+、Hg2+时，识别部分的氮原子、羧基氧原子提供孤对电子，金属离子提供空轨道，形成弱的配位作用，从而减弱了氮原子的供电子能力，完全阻断或部分削弱了ICT过程，导致T13-Cu2+/Hg2+体系荧光猝灭或强度减弱[14-15]，与T13对Cu2+、Hg2+的猝灭型识别作用相符合。此外，过渡金属离子还可通过自旋-轨道耦合、电子或能量转移使荧光基团荧光猝灭，导致荧光猝灭型响应。但由Irving-Williams规则可知，Zn2+呈现较弱的配位能力，其配位稳定性明显弱于Cu2+、Hg2+，且极化能力与变形性较弱、空轨道较少。此外，Zn的还原性远大于Cu和Hg，也导致Zn2+作为电子受体的能力较弱、较难接受氮原子孤对电子进行配位，致使T13-Zn2+体系呈现与T13-Cu2+/Hg2+相反的识别方式。探针结构中，识别基团结合目标物Zn2+、Cu2+、Hg2+的包合空腔[16-17]及可能识别机制如图9所示。

图9 探针T13对Zn2+/Cu2+/Hg2+的识别作用与ICT荧光响应机制Fig.9 Recognition of probe T13 for Zn2+/Cu2+/Hg2+ and fluorescence signaling based on ICT mechanism

3 结论

基于ICT机制定向构筑探针结构，进行水环境中探针-Zn2+/Cu2+/Hg2+的定性及定量识别性能分析，结果显示，探针对Zn2+、Cu2+、Hg2+表现特征响应，荧光性能稳定、线性关系良好，探针与目标离子以1∶1定量结合，能够进行水环境中Zn2+、Cu2+、Hg2+的定性检测和定量分析，初步满足μmol·L-1数量级的生理Zn2+、Cu2+、Hg2+浓度检测。此外，结合荧光、紫外吸收等光谱学手段，初步阐明了探针对Zn2+、Cu2+、Hg2+的不同识别机制，对于未来工作中的探针结构优化、性能筛选与探针-目标离子的生物学成像研究提供了理论基础。