白藜芦醇对实验性兔肺动脉高压相关炎症因子表达的研究

官占江 黑炳昌 郝文波 姜云飞 孟宪国 王媛媛 于海涛 杨磊

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一大类以肺动脉压进行性升高为特点的肺血管疾病。前列环素是目前临床应用最主要的治疗方法，通过降低肺血管阻力和肺动脉平均压，使得患者的生活质量得到明显改善，并延长患者的生存时间，但不能从根本上达到治愈PAH的目标[1-2]。白藜芦醇（resveratrol，Res）一种生物性很强的非黄酮类多酚化合物，是自然界多种植物抵抗外来侵害时产生的一种植物。Res具有抗氧化、阻滞细胞周期等多种作用，在各种体内外实验表明其在肺循环中发挥抗增殖、抗氧化、抗炎和内皮保护作用，并防止PAH的进展[3-4]。然而目前对于PAH中白藜芦醇干预后主要炎症因子IL-6、TNF-α表达水平的影响研究较少，本研究旨在通过研究白藜芦醇干预后实验性兔PAH模型肺组织中主要炎症因子IL-6、TNF-α表达水平的差异，探讨白藜芦醇在PAH发病机制中的改善作用及临床意义。为控制及治疗这种肺血管破坏性疾病提供新的治疗靶点和临床策略。

1 资料与方法

1.1 实验动物

购买90只健康的新西兰兔[中南大学湘雅二医院实验动物室，合格证：SCXK（湘）2015-0003）]，雌雄各占一半，体质量约1.5～2.0 kg。

1.2 实验试剂

白藜芦醇中南大学化学化工学院研制并提供，纯度为98.5%；前列腺环素胶囊购自浙江海正药业股份有限公司，批号：0504081。二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、野百合碱（monocrotaline，MCT）购自美国Sigma公司，检测试剂盒购自美国R&D公司。试药浓度配置：白藜芦醇高剂量为120 mg/kg，中剂量为60 mg/kg，低剂量为30 mg/kg；前列腺环素浓度为1 mg/mL。

1.3 实验方法

1.3.1 模型复制和动物分组 本实验采用MCT腹腔注射方式造兔PHA模型[5-6]，建模前，每日观察动物的行为活动、食量、毛色及大小便变化，并每周称量体质量，待动物的精神状体均达标后，随机选取15只动物作为对照组，标记为A组，并皮下注射DMSO 30 mg/kg。剩余75只实验动物适应性饲养1周后，皮下注射MCT 30 mg/kg，复制PAH动物模型，连续注射7 d后，将75只造模动物随机分5组，每组各15只，分别为模型组，标记为B组；阳性药物对照组，标记为C组，高剂量组，标记为D1组；中剂量组，标记为D2组；低剂量组，标记为D3组。

1.3.2 给药 对动物体质量进行称量，按照动物体质量计算给药剂量，将前列腺环素配成动物模型浓度1 mg/mL的溶液，并以1 mg/（kg·d）喂饲C组动物；将白藜芦醇配置成高剂120 mg/kg，中剂量60 mg/kg，低剂量30 mg/kg，并以高剂量120 mg/（kg·d）、中剂量 60 mg/（kg·d）、低剂量 30 mg/（kg·d）分别喂饲D1、D2、D3组动物，连续喂饲6周，实验全程无动物死亡。

1.3.3 检测TNF-α和IL-6的水平 自开始给药起，每隔2周随机抽取各组实验动物外周血样本，采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒，分别对实验动物血液样本中TNF-α和IL-6的含量进行检测。每份标本双空白对照，严格按试剂盒说明书进行检测。最后用酶标仪在450 nm波长下测量各孔吸光度值，并计算血液样本中TNF-α和IL-6的含量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0软件对数据进行处理，两组实验动物炎性因子水平等计量资料用（）表示，比较差异采用t检验，计数资料用（n，%）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇血清TNF-α表达量比较

实验性兔肺动脉高压造模成功后，与A组相比，B组、C组、D1组、D2组和D3组在第2周、4周、6周的TNF-α表达量均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05），与B组相比，治疗组C组和D1组、D2组和D3组均能够显著降低TNF-α水平，差异有统计学意义（P＜0.05），D1组降低效果显著优于C组，差异有统计学意义（P＜0.05），但D2、D3组治疗效果与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05），具体数据见表1。

表1 静息状态下血清TNF-α表达水平比较（ng/L，）

表1 静息状态下血清TNF-α表达水平比较（ng/L，）

注：*表示P＜ 0.05，第 2 周同 A 组相比，B 组、C 组、D1 组、D2 组、D3 组比较t=8.66、4.34、2.22、4.844、5.853，P＜ 0.05，第4周同A组相比，B组、C组、D1组、D2组、D3组比较t=8.418、4.257、2.186、4.477、5.180，P＜0.05，第6周同A组相比，B 组、C 组、D1、D2 组、D3 组组比较t=8.113、4.240、2.449、4.812、4.963，P＜ 0.05；#表示P＜ 0.05，第 2 周同 B 组相比，C 组、D1、D2组、D3组组比较t=4.671、7.826、4.535、2.705，P＜0.05，第 4周同B组相比，C组、D1组、D2组、D3组比较t=4.609、6.847、4.424、3.058，P＜ 0.05；第 6 周同 B 组相比，C 组、D1 组、D2 组、D3 组比较t=4.275、6.470、3.845、3.106，P＜0.05；Δ表示P＜0.05，第2周同C组相比，D1组比较t=2.871，第4周同C组相比，D1组比较t=2.312，第6周同C组相比，D1 组比较t=2.167，P＜ 0.05。

组别 第2周 第4周 第6周A 组（n=15） 70.61±18.23 78.29±19.32 88.21±20.31 B 组（n=15） 136.48±23.15* 148.14±25.68* 161.33±28.39*C 组（n=15） 100.25±19.14*# 109.14±20.36*# 121.37±22.47*#D1 组（n=15） 83.29±12.53*#Δ 93.06±17.64*#Δ 105.31±17.85*#Δ D2 组（n=15） 102.37±17.68*# 110.72±20.34*# 125.57±22.17*#D3 组（n=15） 114.06±22.23*# 120.08±24.56*# 130.47±25.98*#

2.2 白藜芦醇血清IL-6表达量比较

实验性兔肺动脉高压造模成功后，与A组相比，模型组B组、C组、D1组、D2组、D3组在第2周、4周、6周的IL-6表达量均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05），与B组相比，治疗组C组、D1组、D2组、D3组均能够显著降低IL-6水平，差异有统计学意义（P＜0.05），D1组降低效果显著优于C组，差异有统计学意义（P＜0.05），但D2组、D3组治疗效果与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05），具体数据见表2。

表2 静息状态下血清IL-6表达水平比较（ng/L，）

表2 静息状态下血清IL-6表达水平比较（ng/L，）

注：*表示P＜ 0.05，第 2 周同 A 组相比，B 组、C 组、D1 组、D2 组、D3 组比较t=9.470、4.376、2.336、4.228、4.965，P＜ 0.05，第4周同同A组相比，B组、C组、D1组、D2组、D3组比较t=9.533、3.937、2.168、4.205、5.837，P＜0.05，第6周同A组相比，B组、C组、D1组比较t=8.867、5.004、3.316、5.177、5.276，P＜0.05；#表示P＜0.05，第2周同B组相比，C组、D1组、D2组、D3 组比较t=5.432、7.858、4.699、2.915，P＜ 0.05，第 4 周同 B 组相比，C 组、D1 组、D2 组、D3 组比较t=4.642、7.992、4.830、3.071，P＜ 0.05；第 6 周同 B 组相比，C 组、D1 组、D2 组、D3 组比较t=3.943、6.240、4.613、2.923，P＜ 0.05；Δ 表示P＜ 0.05，第2周同C组相比，D1组比较t=2.36，第4周同C组相比，D1组比较t=2.38，第6周同C组相比，D1组比较t=2.15，P＜0.05。

组别 第2周 第4周 第6周A 组（n=15） 65.26±13.45 71.32±12.48 75.63±14.07 B 组（n=15） 123.06±19.44* 132.17±21.34* 145.03±26.85*C 组（n=15） 88.32±15.35*# 96.22±21.08*# 109.57±22.18*#D1 组（n=15） 76.29±12.39*#Δ 81.19±12.45*#Δ 94.22±16.54*#Δ D2 组（n=15） 90.37±18.66*# 96.28±19.31*# 106.39±18.21*#D3 组（n=15） 100.06±23.58*# 108.34±21.16*# 116.54±26.53*#

3 讨论

PAH实质为一种破坏性疾病，其特征是肺血管内皮细胞（endothelial cell，ECS）过度增殖和血管阻塞，导致肺血管阻力持续增加，血管重塑，最终导致肺动脉高压右心室肥厚与衰竭，生存期有限，与潜在病因无关，具有极高的发病率和死亡率[7-8]。PAH发病机制较为复杂，涉及多种机制，肺内皮功能障碍、持续性血管收缩、慢性肺部炎症和免疫功能紊乱，肺动脉壁内的各种血管细胞（肺内皮细胞和血管平滑肌细胞）、成纤维细胞、肌成纤维细胞和周细胞，以及肺血管细胞和各种免疫细胞之间的协同作用，以及各种关键生长因子、激素、趋化因子和细胞因子对信号通路和转录因子的过度激活。早期对肺动脉高压的治疗主要局限于改善症状，而没有对PAH针对性较强的有效药物，如钙通道阻滞药、抗凝血药等，虽然能短期改善血管环境，延缓患者病情，但是疗效有限，不能达到治愈PAH的目标。有研究[9]表明，细胞增殖引起血管闭塞是PAH最重要的特征，由于肺动脉平滑肌细胞异常增殖导致不可逆肺血管重构，血管闭塞的低氧环境下炎症细胞释放大量细胞因子浸润重构肺动脉周围，进而加剧肺血管内皮细胞损伤和平滑肌细胞增殖加剧，最终促使心脏衰竭，这也是PAH导致患者死亡的重要原因，因此，对PAH治疗的重点由扩张血管药物转向逆转肺血管重构转变。然而，新的药理学提出，PAH许多细胞因子在PAH的形成中有着紧密的联系，TNF-α、IL-6等细胞因子能增加肺血管的反应性，减少肺动脉平滑肌细胞前列腺素的合成，诱导肺血管收缩[10-12]，新药物干预要着眼于对抗各种促增殖因子或抑制平滑肌细胞炎症因子的渗出，抑制平滑肌细胞增殖，阻抑炎症细胞因子的作用，改善肺动脉微环境是治疗PAH新的方向[4]。最近研究[13-14]显示，IL-6可能是PAH和低氧性PAH发病机制中最重要的细胞因子之一。临床资料显示，与正常患者相比，PAH患者血清IL-6水平明显升高，促进平均肺动脉压升高和终末肺小动脉的肌化、增生，在PAH患者中TNF-α炎性细胞因子水平也明显升高，Ⅱ型肺泡上皮细胞中TNF-α的过度表达可导致慢性肺部炎症、间隔破坏、细支气管炎和PAH，当TNF-α以高水平表达时，可刺激机体产生大量活性氧而损伤血管内皮，且可一定程度上抑制血管舒张前列环素2的mRNA表达，进一步加强肺血管收缩导致肺动脉压升高[15]。本研究结果显示，模型组血清中的TNF-α、IL-6水平明显高于对照组，这表明TNF-α、IL-6在PAH形成中有紧密的联系，高剂量的Res干预后能显著降低模型组实验动物的炎性因子的水平，这也在一定程度上说明，Res可以通过抑制炎症因子，减轻及缓解PAH症状。阳性对照药物前列腺环素是治疗PAH首选药物，从实验结果可以看到，高剂量的Res降低炎症在因子水平要高于前列腺环素，而中、低剂量的Res降低炎症因子水平不及前列腺环素的治疗效果。

综上所述，白藜芦醇能显著抑制炎症因子，并通过抑制炎症因子降低细胞损伤，进而改善PAH症状。但是由于PAH作用机制较为复杂，早期症状不明显，Res对PAH的治疗效果是否更优于前列环素有待进一步研究。