微生物法测定功能性饮料中维生素B12含量研究

晏 涛， 刘 萍， 郦 娟， 陈 琼， 陈 哲， 郑 楠， 曾慧君*

(1.武汉食品化妆品检验所, 武汉 430040；2.国家市场监管重点实验室(食用油质量与安全), 武汉 430040；3.武汉职业技术学院, 武汉 430072)

维生素B12作为一种常见的食品添加剂，主要用于保健食品、谷物、饮料、乳品及孕婴食品的营养强化剂[1-3].随着现代生活水平的提高和全民保健意识的加强，人们更多地希望从日常饮食中补充所需的营养元素，因此许多种类的功能性维生素饮料应运而生.

维生素B12的检测至今是国际食品分析的难题之一，主要是由于维生素B12的结构形式多样，至少有5种相似结构包括氰钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺、羟钴胺等，且不同钴胺素对维生素B12的缺陷菌——ATCC 7830敏感性不同[4-6].化学发光法检测维生素B12存在检测限低，容易受到基质中金属离子干扰等问题[7-8].液相色谱法测定维生素B12存在灵敏度相对较差、特异性不高，对于复杂基质中维生素B12的测定存在很多困难等缺陷[9-10].因此美国分析化学家协会(AOAC)标准和中国食品安全国家标准GB 5413.14—2010都将微生物法作为检测维生素B12的首选方法和仲裁法[11-13].

目前许多市售功能性饮料企业标准中维生素B12的检测方法均指向GB 5413.14—2010(以下简称国标法)，而国标法中明确规定该标准的检测方法只适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定[14].本研究旨在建立一种快速准确测定功能性饮料中维生素B12含量的方法，从而确保市售功能性饮料添加量符合食品安全标准相关要求，避免消费者因为饮用不合格饮料可能引起的身体损伤.

本研究以功能性饮料为研究对象，参考国标法，对样品前处理进行了优化改良，极大缩减了检验时间，并准确测定出功能性饮料中维生素B12的含量.本研究为功能性饮料中维生素B12的准确测定提供方法依据，为监管部门对功能性饮料中B12的监测提供技术支撑.

1材料与方法

1.1材料、菌种与试剂

材料：5种不同标示值市售功能性维生素饮料均购于武汉市内零售超市，为避免广告嫌疑，编号1～5，详细信息见表1.

表1 样品信息Tab.1 Sample information

菌种：莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillusleichmannii)ATCC 7830(中国工业微生物菌种保藏管理中心).

试剂：乳酸杆菌琼脂培养基、乳酸杆菌肉汤培养基和维生素B12测定用培养基(美国 BD 公司)；维生素B12标准品(99.2%，美国Sigma-aldrich公司)；无水磷酸氢二钠、无水偏重亚硫酸钠、一水合柠檬酸(分析纯，广州化学试剂厂).

1.2仪器和设备

测定过程中用到的仪器设备如下：电子天平(ME204/02，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)；恒温培养箱(LBI-300，上海龙跃仪器设备有限公司)；高压蒸汽灭菌锅(SX-700，日本TOMY数字生物有限公司)；涡旋振荡器(vortex-genie2，美国SI仪器公司)；离心机(H1850R，湖南湘仪仪器有限公司)；紫外可见光分光光度计(UV-2700，岛津公司)；超净工作台(BSC-1600ⅡA2，苏州安泰空气技术有限公司)；酶标仪(iMark，美国BIO RAD公司).

1.3实验方法

1.3.1样品称(量)取、处理和稀释 第一组(国标处理组)，取适量试样，转入250 mL锥形瓶中，加入10 mL缓冲液(每100 mL含无水磷酸氢二钠1.3 g、无水偏重亚硫酸钠1.0 g、一水合柠檬酸1.2 g)，加入少量水，121 ℃水解10 min，冷却.用盐酸(0.1 mol·L-1)调pH至4.5±0.2，转入250 mL容量瓶中用水定容.过滤，吸取适当体积上述液体，加入适量水，用氢氧化钠(0.1 mol·L-1)调节pH至6.8±0.2，转入100 mL容量瓶用水定容至刻度(使稀释液中维生素B12浓度在0.01 ng·mL-1～0.02 ng·mL-1范围内).第二组(改良国标处理组)，取适量试样，加入10 mL缓冲液，充分混匀加热煮沸10 min后调节pH至6.8±0.2，转入100 mL容量瓶定容至刻度.每种饮料做6次重复性实验以保证结果的准确性.

1.3.2实验用菌悬液的制备 将冻干保存的莱士曼氏乳杆菌转接至乳酸杆菌琼脂培养基上，37 ℃培养20～24 h，连续传种2～3次以活化菌株.将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，37 ℃培养20～24 h，离心弃上清用生理盐水稀释反复洗涤3次以去掉乳酸杆菌培养基，然后用紫外分光光度计调节菌液浓度.使其透光率在70%左右.

1.3.3维生素B12标准溶液的制备 精确称取10.0 mg维生素B12标准品，加25%乙醇溶液溶解并转移至1 000 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即为维生素B12标准储备液.准确吸取上述溶液5.0 mL维生素B12标准储备溶液置于500 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即为维生素B12标准中间液.准确吸取5.0 mL维生素B12标准中间液置于500 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即为维生素B12标准工作液.临用前分别吸取两个5.0 mL维生素B12标准工作溶液到250 mL和500 mL容量瓶中，用水定容至刻度备用.

按表2制作标准曲线， 为保证标准曲线的线性关系，每根标准系列管制作了3个重复.

表2 标准曲线的制作Tab.2 Preparation of the standard curve

1.3.4样品待测液的制备 取4支试管分别加入1.00 mL、2.00 mL 、3.00 mL、4.00 mL试样提取液，补水至5.00 mL，加入5.00 mL维生素B12测定用培养液，混匀，一式三份.

1.3.5接种培养 将所有测定管封闭，于121 ℃高压灭菌5 min后迅速冷却，在无菌操作条件下向每支试管滴加1.3.2中接种液50 μL，盖好塞子置于36±1 ℃恒温培养箱中培养19～20 h，直到达到最大浑浊度，其中S1管不加菌液做空白对照.

1.3.6吸光度测定 在550 nm处，使用紫外可见光分光光度计UV-2700以未接种的S1对照管调节吸光度值为0，读出S2管的数值.再以S2管为空白，调节吸光度为0，依次读出其他每支试管的吸光度.

2结果与分析

2.1标准曲线分析

以标准系列管中维生素B12含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制维生素B12标准曲线.紫外分光光度计测得维生素B12标准曲线方程为：y=5.5976x+0.0357，相关系数R2为0.993 8，在0～0.1 ng范围内，吸光度值与维生素B12含量之间的线性关系良好.

2.2样品检测结果分析

2.2.1样品前处理优化及精密度结果 根据1.3.1中测得的标准曲线和测得的样品试管的吸光度值计算所测5种不同标示值的功能性维生素饮料中的维生素B12含量，结果如表3所示.

图1 维生素B12标准曲线Fig.1 Standard curve of vitamin B12

表3 微生物法测得功能性饮料中维生素B12结果Tab.3 Results of vitamin B12 in functional beverage by microbiological method

由表3可知，5种功能性维生素饮料6次平行测定的标准偏差在0.2～0.5之间，RSD在1.55%～3.68%之间，说明各独立实验之间的检测数据重复性较好.对比5种功能性维生素饮料的实际测定值和标签值发现，5种功能性维生素饮料的维生素B12检测含量均符合相关标准要求.第一组和第二组的测定结果用SPSS 18.0软件进行统计学分析，差异不显著(p值大于0.05)，提示改良优化的样品前处理方法即改良国标处理法，也能准确测定出功能性饮料中B12的含量，可作为微生物法的首选样品处理方式.

2.2.2质量控制检测结果

1) 试剂盒法检测结果.使用德国拜发商品化试剂盒测定了5种功能性维生素饮料的维生素B12含量，结果如表4，将该结果与微生物法的测定结果用SPSS 18.0软件进行统计学分析，两者没有统计学差异(p值大于0.05).

表4 试剂盒法测得功能性饮料中维生素B12结果Tab.4 Results of vitamin B12 in functional beverage by kit method

2) 加标回收检测结果.为确保微生物法测定功能性饮料中维生素B12含量的准确性和结果的有效性，对试样3进行加标回收试验，取1 mL试样3进行试验，其本底值为11.4 ng，进行三个梯度加标试验，加标量分别为5.0、10.0、20.0 ng，使用上述改良国标处理组的方法进行试样处理，做3次重复平行实验，根据平均值计算回收率，回收率(%)=(实测值-本底值)/加标量×100.结果如表5，平均回收率在92%～104%，符合要求.

表5 加标回收实验结果Tab.5 Rate of standard recovery

2.3方法比较

虽然微生物法(国标法及改良国标法)与试剂盒法在检测功能性饮料中维生素B12的含量无显著差异，但这三种方法有其各自特点，见表6.

表6 三种检测方法的比较Tab.6 Comparison of three methods

试剂盒法不需要准备菌悬液，可适用于无标准菌株无法制备菌悬液的实验室，但试剂盒法价格昂贵，且是非标方法，不利于在检验机构推广.国标法一直是维生素B12检测的指定方法，我们建立的改良国标法为功能性饮料中维生素B12含量检测的微生物方法标准的制定提供了技术参考.

3讨论

国标GB 5413.14—2010适用范围为婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定，而诸多功能性饮料生产企业都在企业标准中将其作为维生素B12的指定检测方法，探讨国标法对功能性饮料中B12的检测显得尤为重要.国标法样品前处理针对的是婴幼儿食品和乳品，食品基底是固体物质且含有大量蛋白质，需要变性和过滤过程去除，而维生素功能性饮料是液体基底且不含蛋白质成分.基于此，本研究对国标法进行了改良优化，在样品前处理中直接加入含有偏重亚硫酸钠的缓冲液经加热煮沸将功能性饮料中不稳定形式的钴胺素转变为稳定状态的亚硫酸合钴胺素[15]，冷却后直接调pH定容进行检测，省去了国标法中繁琐的变性、过滤等步骤，并将样品处理过程中的2次调节pH直接缩减为1次，操作更为便捷，将单个样品处理时间直接由原来的2 h缩短至0.5 h.此外，与试剂盒法相比，本实验方法检测成本更低，试剂盒法单个样品的成本在500元左右，本实验方法单个样品的检测成本在220元左右，且试剂盒法不是主流的维生素B12检测技术，在实际检测过程中美国分析化学家协会和中国食品安全国家标准均将微生物法作为首先方法和仲裁法，试剂盒法为非标方法只能作为辅助检测方法.本实验使用微生物法准确测定出功能性饮料中维生素B12的含量，测定结果灵敏性好、准确度高，为功能性饮料中维生素B12的检测提供了可靠方法，为相关标准制定提供技术指导.

综上，本研究有效建立了一种基于国标改良法的功能性饮料中维生素B12含量的微生物检测方法，且相较于国标法具有检测步骤简单、省时、操作便捷等优点，相较于试剂盒法具有检测成本低廉的优势.由于微生物法的方法优势，已有研究组将微生物法应用于发酵食品中维生素B12的测定[16-17]，随着实验方法的不断优化和创新，微生物法将被应用到更多食品中维生素B12的测定.