结直肠癌微卫星不稳定性与程序性死亡配体1 表达的临床意义

侯少华， 齐立温， 纪小红， 唐超峰， 李 海

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院，银川 750004）

根据全球癌症流行病学的数据库（GLOBOCAN）2020 年数据显示[1]，结直肠癌发病率、死亡率均居前三位，严重危害人类健康。近年来免疫治疗在特定患者人群中表现出显著的疗效。2015 年Le 等[2]首次发现了具有错配修复缺陷（dMMR）或高度微卫星不稳定性（MSI-H）分子的表型转移性结直肠癌（mCRC）能从免疫检查点抑制剂程序性死亡配体1（PD-L1）单抗（Pembrolizumab）免疫治疗中显著获益。因此，本研究主要研究结直肠癌微卫星不稳定性（MSI）与PD-L1表达的临床病理特征和相关临床意义，并分析PCR检测MSI 与IHC 检测MMR 两种方法结果的一致性，并进一步细分MSI-H 类型突变位点的多少及突变率，探索能否富集/筛选优势人群[3]，以期为PD-L1 单抗在结直肠癌个体化精准治疗的临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2019—2020 年在宁夏医科大学总医院接受结直肠癌切除术、术后病理确诊为结直肠癌的患者116 例作为研究对象，其中男性73 例，女性43 例；年龄25～80 岁，平均年龄57.4 岁；肿瘤部位：右半结肠24 例，左半结肠10 例，直肠82例；肿瘤类型：黏液腺癌11 例，其他腺癌103 例，印戒细胞癌2 例；pTNM 分期：Ⅰ期16 例，Ⅱ期53例，Ⅲ期47 例，病理分期按AJCC 结直肠癌第8版TNM 分期标准；肿块直径：≤5 cm 者76 例，>5 cm 者40 例；有神经侵犯38 例，无神经侵犯78例；有脉管癌栓38 例，无脉管癌栓78例；有淋巴结转移49 例，无淋巴结转移67 例。本课题得到宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（KYLL-2021-1086），患者及家属签署知情同意书。

1.2 多重PCR 检测结直肠癌组织中MSI 位点

行结直肠癌手术的116 例患者中96 例送迪安公司检测MSI，检测位点包括6 个微卫星位点（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27）。采用多重PCR 方法对6 个微卫星位点进行扩增来确定MSI，判读单核苷酸重复标志物中没有发生改变为MSI 稳定型（MSS）；单核苷酸重复标志物中仅有1 个发生改变为MSI 低频型（MSI-L）；单核苷酸重复标志物中有≥2 个发生改变为MSI 高频型（MSI-H）。

1.3 免疫组化检测结直肠癌组织中PD-L1 的表达

将结直肠癌患者行手术切除的新鲜肿瘤组织送迪安公司检测PD-L1，共83 例，采用免疫组化（IHC）方法进行检测。判读标准：肿瘤细胞膜中PD-L1 染色比例。阴性（0），无着色；弱阳性（+），任何比例的细胞呈现微弱、不完整膜着色；阳性（++），＞10%的细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀膜棕黄着色；强阳性（+++），＞30%的细胞呈现强、完整膜棕褐着色。

1.4 免疫组化检测结直肠癌组织中MMR 蛋白表达

将结直肠癌患者行手术切除的新鲜肿瘤组织送宁夏医科大学总医院病理科检测，通过IHC方法分别采用针对MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2的特异性抗体，免疫组织化学切片由病理科医师阅片判读，阳性表达定位于细胞核，如果肿瘤样本中4 个MMR 蛋白均阳性表达，则为MMR 功能完整（pMMR）；4 个MMR 蛋白中任何一个不表达，即为MMR 蛋白缺失（dMMR）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2或Fisher确切概率法。P≤0.05 为差异有统计学意义。采用Kappa 分析免疫组化检测MMR 蛋白和PCR 的毛细管电泳法检测MSI 的一致性。

2 结果

2.1 结直肠癌患者肿瘤组织中MSI 检测结果

在96 例肿瘤组织标本中，MSI-H 有13 例，发生率为13.5%（13/96）；MSI-L 有4 例，发生率为4.2%（4/96）；MSS 有79 例，发生率为82.3%（79/96）。13 例MSI-H 存在NR-21 位点改变的有8 例，突变率占61.5%（8/13），NR-27 位点改变的有13例，突变率占100%（13/13），NR-24 位点改变的有3 例，突变率占23.1%（3/13），BAT-26 位点改变的有10 例，突变率占76.9%（10/13），BAT-25 位点改变的有7 例，突变率占53.8%（7/13），MONO-27 位点改变的有0 例，突变率占0%（0/13）。

2.2 MSI 与结直肠癌临床病理特征的相关性

结果显示，MSI-L/MSS 与MSI-H 的结直肠癌患者之间肿瘤部位、肿瘤直径、分化程度间差异均有统计学意义（P 均＜0.05），而浸润深度、pTNM 分期、有无神经或脉管侵犯、有无淋巴结转移两者间差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见表1。

表1 结直肠癌患者MSI 与临床病理特征的关系

2.3 结直肠癌患者肿瘤组织MSI 基因检测与MMR 免疫组化结果一致性分析

在96 例结直肠癌肿瘤组织标本中，基因检测结果MSI-H 的有13 例，MSI-L/MSS 的有83 例。免疫组化检测结果dMMR 的有20 例，其中MLH1和PMS2 双突变8 例，MSH2 和MSH6 双突变3例，PMS2/MSH6/MLH1 单突变9 例；pMMR 的有76 例。两者经Kappa 一致性检验，结果一致性较好（Kappa=0.674），见表2。

表2 结直肠癌患者肿瘤组织MSI 基因检测与MMR免疫组化结果一致性分析

2.4 结直肠癌患者肿瘤组织中PD-L1 的表达

在83 例肿瘤组织标本中，PD-L1 阳性表达率为42.2%，其中弱阳性（+）10 例，阳性（++）1 例，强阳性（+++）24 例，阴性表达率为57.8%，见图1。

图1 PD-L1 在结直肠癌患者肿瘤组织中的表达（免疫组化染色×400）

2.5 结直肠癌患者肿瘤组织中PD-L1 表达与临床病理特征的关系

结直肠癌患者PD-L1 表达在性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、分化程度、浸润深度、pTNM分期、有无神经或脉管侵犯、有无淋巴结转移之间差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见表3。

表3 结直肠癌患者肿瘤组织中PD-L1 表达与临床病理特征的关系

2.6 PD-L1 在MSS/MSI-L 和MSI-H 的结直肠癌患者肿瘤组织中的表达

既行MSI 检测又行PD-L1 检测共63 例，其中PD-L1 在MSI-L/MSS 的结直肠癌患者肿瘤组织中的阳性率（28.3%）低于MSI-H 的结直肠癌患者（70.0%）（P＜0.05），见表4。

表4 PD-L1在MSS/MSI-L 和MSI-H 的结直肠癌中的表达

3 讨论

2017 年，NCCN 指南首次将免疫检查点抑制剂PD-1 单抗Pembrolizumab 和Nivolumab 推荐用于具有dMMR/MSI-H 分子表型的mCRC 的末线治疗[4]，免疫治疗也成为继外科手术、放化疗之后又一种重要的治疗方法。因此识别dMMR/MSI-H 结直肠癌和研究MSI 与PD-L1 表达的关系具有重要的临床意义。

结肠基于胚胎发育、血液供应、解剖和功能等的差异，可将其分为右半结肠（盲肠、升结肠和横结肠右半部）和左半结肠（横结肠左半部、降结肠和乙状结肠）[5]。本研究结果显示，MSI-H 表型结直肠癌患者具有明显且独特的临床病理特征：即位于右半结肠、肿瘤直径较大、分化程度主要为中分化，这可能与右半结肠生物学特点有关，且与大多数文献所报道的结果相一致[6-7]。MSI 基因检测虽然作为dMMR 筛选的“金标准”，但复杂的程序和昂贵的成本难以在临床筛查中普遍实施，特别是在经济欠发达地区。因此，本文分别通过IHC 法检测MMR 蛋白和PCR 法检测MSI，并对检测结果进行了统计分析。两种检测方法经Kappa 一致性检验，结果一致性较好。这与国内外相关报道[8]的结果相吻合，可为IHC检测MMR 蛋白作为一种初筛手段提供理论依据。Luchini 等[9]报道，PMS2 和MSH6 分别与MLH1和MSH2 协同，其表达非常依赖与伴侣蛋白的结合情况，即MLH1 表达缺失通常伴有PMS2 表达缺失，而MSH2 表达缺失通常伴有MSH6 表达缺失[10]。本研究很好地证实了这一点，经过统计，MMR缺失的类型以MLH1 和PMS2 双突变为主，其次为PMS2/MSH6 单突变。同时我们也发现了在9例PMS2/MSH6 单突变中，虽然蛋白表达缺失，IHC表现为dMMR，而PCR 却显示MSS 的有6 例。建议IHC 表现为dMMR 的PMS2/MSH6 单突变的患者可行PCR 复检。

PD-L1 信号通路是一种负反馈系统[11-12]，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞的PD-L1 表达，从而利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。Xiao 等[13]研究发现，在MSI 肿瘤的微环境中存在免疫检查点相关蛋白的显著表达[14]。根据非小细胞肺癌的临床实验结果，如果肿瘤组织以及肿瘤周围组织的PD-L1 表达率＞1%，使用PD-1 抗体的疗效就会明显增加，如果PD-L1 的表达率超过50%，预示PD-1 抗体的疗效会很显著。在本研究中，MSI-H 的结直肠癌患者癌组织中PD-L1 呈高表达，这与有些研究[15-16]成果一致，且证实了LE 等的研究结果。即具有dMMR 或MSI-H 分子表型mCRC 可能从PD-L1免疫抑制剂治疗中显著获益，且MSI-H分子表型可以作为免疫检查点抑制剂（ICI）的阳性预测标志物。此外，PD-L1 表达在结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、浸润深度、TNM 分期、有无神经或脉管侵犯、有无淋巴结转移之间差异无统计学意义。饶雄辉等[17]的Meta 分析显示，PD-L1 表达与淋巴结转移、肿瘤分化程度有关。在本研究中，未能得到相同的结论，造成这种差异的原因，可能是入组病例数少有关。

为探索能否进一步富集优势人群，本研究分析了MSI-L 的基因突变位点的多少及突变率，结果在MSI-H 表型的结直肠癌中，NR-27 突变率最高，其次为NR-21 和BAT-26，MONO-27 最低，推测患者在对免疫抑制剂长效治疗中可能与基因突变的多少及突变率有关，此类相关报道较少，有待进一步进行相关的临床研究。

综上所述，本研究证实了在MSI-H 的结直肠癌患者中PD-L1 阳性率高于MSI-L 及MSS 的结直肠癌，MSI-H 分子表型可以作为免疫检查点抑制剂（ICI）的阳性预测标志物。并且IHC 和PCR两种检测结果的一致性较好，可以根据情况，选用适当且经济的检测方法。MSI-H 基因常见突变点为NR-27、NR-21 和BAT-26，可以为PD-L1 在结直肠癌个体化精准治疗的临床应用提供理论依据。