甘草酸对高糖诱导小鼠足细胞损伤的影响

王玉军， 王 珍， 赵天琪， 侯绍章

（宁夏医科大学基础医学院病理学系，银川 750004）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并发症之一，是终末期肾病的主要原因[1]。研究显示，在DN 早期，当系膜细胞和内皮细胞尚未改变时就已出现足细胞损伤，表现为足细胞数量减少，胞体缩小，足突增宽融合、消失，进而引起蛋白尿，导致肾功能恶化进展[2-3]。因此，足细胞损伤被认为是DN 的主要原因之一。

铁死亡（ferroptosis）是一种新型的细胞程序死亡方式，是由于细胞内铁依赖脂质活性氧积聚过多而发生的一种可调节性细胞死亡形式[4]。研究显示，铁死亡在DN 发生、发展中起重要作用[5]。因此，铁死亡有望成为DN 临床治疗和相关药物研发的一个新靶点。

传统的DN 治疗方法如控制饮食、降低血糖水平以及药物治疗[6]的效果有限，并不能够延缓或阻止DN 的进展[7]。近年来，从中草药中寻找治疗DN 可能的方法和药物成为防治DN 的研究热点。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是从甘草中提取的含量最高的皂苷类成分，研究表明，GA 表现出诸如抗溃疡、祛痰、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤、神经保护和增强免疫等多种药理作用[8-10]。课题组前期研究显示，GA 对DN 具有一定的保护作用[11-13]，但GA 能否通过影响DN 足细胞损伤发挥保护作用尚不明确。本研究通过建立细胞实验，采用高糖诱导足细胞损伤模拟DN，探索GA能否通过调控铁死亡对高糖诱导足细胞损伤起保护作用，以进一步为DN 的治疗积累理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠肾小球足细胞购于上海中乔新舟生物科技有限公司；RPMI1640 培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（FBS）购于以色列BI 公司；青链霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）（含酚红）及甘草酸（纯度：HPLC≥98%）购于北京索莱宝科技有限公司；重组小鼠γ-干扰素（interferon，γ-IFN）购于美国PeproTech公司；D-葡萄糖购于生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8 试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；伊红染色液购于北京索莱宝科技有限公司；改良Lillie-Mayer 苏木素染色液购于北京雷根生物技术有限公司；抗体Nephrin 购于英国Abcam 公司；抗体GPX4、GAPDH、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP 购于Affinity 公司；DyLight 594，Goat Anti-Rabbit IgG 购于Abbkine 公司；BCA 蛋白定量试剂盒、全蛋白提取试剂盒、ECL化学发光液及SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司；ROS 荧光探针-DHE 购于威格拉斯生物技术（北京）有限公司；封闭用正常山羊血清、中性树胶购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将小鼠肾小球足细胞迅速从-80 ℃冰箱中取出，于37 ℃水浴锅中解冻后常规复苏，置于含有10%胎牛血清、1%青链霉素和100 U·mL-1重组小鼠γ-干扰素的RPMI1640培养基，于33 ℃、5%CO2的培养箱中培养，然后转入37 ℃、5%CO2的培养箱中诱导分化，使用10%胎牛血清、1%青链霉素和不含γ-IFN的RPMI1640培养基继续培养10 d 左右。当细胞融合达到80%，使用无血清培养基同步化处理24 h，将细胞随机分为正常对照组（NG，葡萄糖5.5 mmol·L-1）、高糖组（HG，葡萄糖30 mmol·L-1）和高糖+甘草酸组（HG+GA，葡萄糖30 mmol·L-1、甘草酸100 μmol·L-1），各组细胞均培养48 h。

1.2.2 细胞活性检测 将细胞密度以2×103个/孔接种于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h 后，按照1.2.1 做细胞分组处理，各组设5 个复孔，根据试剂盒说明书加入CCK-8 溶液，继续避光孵育2 h，用酶标仪于450 nm 处读取吸光度值，根据公式计算细胞活力：细胞活力=（实验组OD 值-空白组OD 值/对照组OD 值-空白组OD 值）×100%。

1.2.3 HE 染色 将细胞密度以1×104个/孔接种于24 孔板内无菌玻片上，进行细胞爬片，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h 后，按照1.2.1做细胞分组处理，依次使用95%乙醇固定、苏木素染色液染核、伊红染色液染胞质，中性树胶封片，于显微镜下观察细胞形态。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 将各组干预好的细胞置于冰上，PBS 清洗3 次，加入RIPA 裂解液于冰上裂解30 min，用细胞刮子搜集各组细胞，转移至离心管中，4 ℃高速离心10 min，吸取上清液，用BCA 蛋白定量试剂盒测定各组蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸10 min 使蛋白变性，取各组蛋白40 μg，用8%SDSPAGE 凝胶进行电泳（60 V/100 V）。于4 ℃条件下，用200 mA 电流根据目的蛋白分子量大小转膜相应时间，使蛋白转至PVDF 膜上。5%脱脂牛奶溶液室温封闭2 h，TBST 清洗3 次，分别加入一抗Nephrin（1∶1000）、GPX4（1∶1000）、GAPDH（1∶1 000），于4 ℃孵育过夜。次日复温后TBST 洗膜3 次，加入HRP 标记的二抗（1∶3 000），室温孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次，使用ECL 化学发光液显影，GAPDH 作为内参，用软件Image-J 进行灰度值分析，计算蛋白相对表达量。

1.2.5 免疫荧光染色 将干预好的细胞弃去培养基，PBS 洗涤3 次，使用4%多聚甲醛室温固定细胞20 min，PBS 洗涤3 次，0.1%Triton X-100室温透化细胞膜，使用山羊血清室温封闭45 min，弃掉血清，加入适量一抗GPX4（1∶250）于4℃条件下孵育过夜，次日复温后，PBS 洗涤3 次，加入荧光二抗（1∶250）于37℃条件下避光孵育1 h，PBS 洗涤3 次，使用抗荧光衰减封片剂（含DAPI）封片，荧光显微镜下观察、摄图。

1.2.6 ROS 测定 吸净24 孔板内的细胞培养基，用RPMI1640 培养基清洗3 次，加入DHE 浓度为1 μmol·L-1的RPMI1640 培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中避光孵育0.5 h，结束后使用RPMI1640 培养基清洗3 次，于荧光显微镜下观察细胞荧光着色、摄图。

1.2.7 统计学方法 使用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8.0 对数据进行统计学分析及作图，各组实验独立重复3 次，实验数据均以均数±标准差（±s）表示，组间两两比较采用Turkey 法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GA 对高糖环境下足细胞活力的影响

与NG 组相比，HG 组足细胞活力降低（P＜0.01）；与HG 组相比，HG+GA 组足细胞活力升高（P＜0.05），见图1。

图1 各组足细胞活力比较

2.2 GA 对高糖环境下足细胞形态的影响

苏木精-伊红（HE）染色法检测细胞形态学改变，结果显示：NG 组细胞呈长梭形，具有较多突起，由胞体分出许多树枝样分支；与NG 组细胞相比，HG 组细胞胞质淡染，突触减少，树枝样结构明显减少甚至消失；与HG 组相比，HG+GA 组细胞形态有一定程度的改善，与正常细胞形态基本相似，见图2。

图2 各组足细胞在光学显微镜下的形态（HE×400）

2.3 GA 对高糖环境下足细胞Nephrin 蛋白表达的影响

Western blot 实验检测Nephrin 蛋白表达，结果显示：与NG 组相比，HG 组Nephrin 蛋白表达量降低（P＜0.001）；与HG 组相比，HG+GA 组Nephrin 蛋白表达量升高（P＜0.05），见图3。

图3 Western blot 检测各组足细胞Nephrin 的表达情况

2.4 GA 对高糖环境下足细胞GPX4 表达的影响

Westernblot 检测GPX4 的表达结果显示：与NG组相比，HG 组GPX4 蛋白表达量降低（P＜0.001）；与HG 组相比，HG+GA 组GPX4 蛋白表达量升高（P＜0.01），见图4。

图4 Western blot 检测各组足细胞GPX4 的表达情况

2.5 GA 对高糖环境下足细胞GPX4 荧光强度的影响

免疫荧光检测GPX4 的表达结果显示：GPX4主要表达于细胞质，与NG 组相比，HG 组GPX4 的荧光强度减弱（P＜0.01）；而与HG 组相比，HG+GA组GPX4 的荧光强度上调（P＜0.05），见图5。

图5 免疫荧光检测各组足细胞GPX4 的定位及表达情况（×400）

2.6 GA 对高糖环境下足细胞ROS 表达的影响

活性氧（ROS）检测试剂盒检测足细胞内ROS的含量结果显示：NG 组仅有很低的ROS 荧光强度，与NG 组相比，HG 组ROS 荧光强度明显增强；与HG 组相比，HG+GA 组ROS 荧光强度明显减弱，见图6。

图6 各组足细胞ROS 的表达情况（×100）

3 讨论

DN 的发病率比一般疾病高，且疗效差，其特点主要以肾小球血管受损、硬化为主，临床上表现为尿蛋白排泄量增加[14]。足细胞是终末分化的肾小球内脏上皮细胞，可维持肾小球滤过屏障（GFB）的完整性，防止尿蛋白的丢失[15]。Nephrin 蛋白是足细胞特有的标志蛋白，同时也是重要的功能蛋白[16]。Nephrin 蛋白在裂孔隔膜上相互交叉，组成特有的拉链状结构，是阻止大分子蛋白质漏出最为重要的结构。此外，Nephrin 蛋白在介导一系列信号传导、维持足细胞正常形态方面同样起着十分重要的作用[17]。本次研究采用HG 诱导足细胞损伤构建DN 体外细胞模型，结果显示高糖环境下足细胞活力降低，细胞胞质淡染，突触减少，树枝样结构明显减少甚至消失，细胞失去原有的正常形态，Nephrin 蛋白表达水平降低。

GA 是从甘草中提取的含量最高的皂苷类成分，课题组前期研究表明，GA 对DN 具有一定的保护作用[11-13]，但其机制尚未完全阐明。本次研究显示，GA 可提高高糖环境下足细胞活力，对细胞形态也有一定程度的改善作用，提高Nephrin 蛋白的表达水平，表明GA 可改善足细胞功能障碍。

铁死亡是由铁离子参与的脂质过氧化物累积引起的，通过抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运系统Xcˉ进一步激活氧化应激，ROS 的产生可诱导非细胞凋亡形式的铁死亡[18]。铁依赖的脂质ROS的异常积累是铁死亡的标志，也是铁死亡的原因。铁死亡与包括糖尿病在内的各种严重的人类疾病有关[19]。作为一种抗氧化酶，GPX4 催化脂质过氧化物的还原并间接干扰芬顿反应，是铁死亡的重要调节因子[20]。本次研究显示，高糖环境下足细胞GPX4 蛋白表达水平降低，而ROS 升高。GA 干预则可提高GPX4 蛋白表达水平、降低ROS 的表达，表明GA 可抑制高糖环境下足细胞铁死亡现象。

综上所述，GA 可抑制高糖诱导的足细胞损伤，从而延缓DN 并改善足细胞功能，其机制可能与抑制铁死亡有关。