雄激素抑制PI3K/AKT/AR 通路促进前列腺癌C4-2B 细胞凋亡

王振位， 聂黎虹， 杨博雅， 刘子洋， 甄 旭， 赵瑞宁

（1.宁夏医科大学总医院泌尿外科，银川 750004； 2.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004； 3.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性好发恶性肿瘤，在全球范围内，其发病率与病死率分别位居男性恶性肿瘤的第2 位和第5 位，严重危害中老年男性健康[1]。PCa 进展的主要方式由雄激素受体（androgen receptor，AR）信号通路介导，因此干扰该信号通路的功能一直是治疗晚期PCa 的重要措施之一，如雄激素剥夺治疗、AR 阻断治疗等[2]。上述治疗措施仅在初期具有显著疗效，一般3 年左右演变成去势抵抗性前列腺癌（castrate-resistant prostate cancer，CRPC），其患者预后更差、病死率更高[3]。而靶向抑制AR 信号通路的功能依然是CRPC 的重要治疗措施。雄激素在体内作为AR 的主要配体，一直被认为是促进PCa 进展的主要原因[4]。但有临床实验研究[5]发现，PCa 患者根治术后给予雄激素治疗，维持血清睾酮水平在300～375 ng·mL-1，患者肿瘤复发率降低、中位生存期延长。另有研究[6-7]表明，AR信号通路对PCa 的发展具有抑制和促增殖的双向作用。目前，关于雄激素是否可通过调节AR信号通路抑制CRPC 阶段PCa 细胞增殖的研究鲜有报道。本研究采用双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）对C4-2B 细胞进行处理，探讨DHT对C4-2B 细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制，给CRPC 的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

C4-2B 细胞由美国加州大学Davis 分校的AllenC.Gao 教授惠赠；CO2细胞培养箱购于ThermoFisher 公司；DHT 以及渥曼青霉素（wortmannin，WM）购于APExBio 公司；胰蛋白酶、青/链霉素混合液（P/S）、无酚红1640 培养基、一抗稀释液购于北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清（FBS）以及磷酸缓冲盐溶液（PBS）购于Gibco 公司；AnnexinVFITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购于上海贝博生物科技有限公司；全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒、New-SUPERECL 检测试剂盒购于江苏凯基生物科技公司；B 淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2 相关蛋白X（BAX）、裂解型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase3，c-caspase3）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、AR 兔抗人多克隆抗体购于ProteinTech 公司；AR 剪接变异体-7（androgen receptor splicevariant-7，AR-V7）兔抗人多克隆抗体购于Cell Signaling Technology 公司；β-Actin小鼠抗人多克隆抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG 购于北京中杉金桥公司；CCK-8 试剂盒购于赛文创新（北京）科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 C4-2B 细胞培养 C4-2B 细胞在完全培养基（90%无酚红1640 培养基，10%FBS，1%P/S）、恒温37 ℃、5%CO2培养箱中培养。48 h 更换1 次培养基，细胞贴壁生长至80%左右传代。

1.2.2 CCK-8 法检测C4-2B 细胞增殖活性 取对数生长期的C4-2B 细胞，用含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶进行消化，细胞脱落变圆后，加入完全培养基终止消化过程，1 000 r·min-1离心5 min；弃去上清液，同时加入完全培养基、重悬细胞，以5 000 个/100 μL 将细胞接种至96 孔板。设置空白组、对照组（0 ng·mL-1DHT）和DHT 浓度梯度组0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 ng·mL-1，每组设3 个复孔；CO2培养箱内培养，细胞完全贴壁后，各组予以相应处理，记为第1 天，48 h 更换含有不同浓度DHT 的完全培养基1 次，于第10 天终止培养。以换液的形式各孔加入含10%CCK-8 试剂的完全培养基，37 ℃条件孵育1 h，设置酶标仪450 nm 波长，检测各孔吸光度A 值并进行数据统计学分析。细胞存活率=［（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）］×100%。

1.2.3 细胞形态学观察 取对数生长期C4-2B细胞，接种于6 孔板，使每孔细胞为1.5×104个，24 h 细胞贴壁后，予DHT 干预。设置对照组（0 ng·mL-1）、DHT 处理组（0.25、0.5 ng·mL-1）；48 h 更换含相应浓度DHT 的培养基，于第7 天在倒置相差显微镜（×100）下观察细胞形态变化并拍照。

1.2.4 平板克隆形成实验检测DHT 对C4-2B 细胞增殖的影响 取对数生长期的C4-2B 细胞，用6 孔板接种细胞，密度为800 个/孔。孵育24 h待细胞贴壁后，加入0、0.25、0.5 ng·mL-1DHT 处理，于培养箱中孵育，7 d 更换1 次含相应浓度DHT 的培养基，干预第14 天终止实验。PBS 漂洗2 次，预冷甲醇固定20 min；弃甲醇，每孔加入1 mL 结晶紫溶液（0.1%）染色处理0.5 h，PBS 再次漂洗2 次，空气干燥。拍照并记录肉眼可见克隆形成数目，计算克隆形成率，每组实验重复3次，数据用Image J 进行处理。克隆形成率=（克隆形成数/接种细胞数）100%。

1.2.5 流式细胞术检测C4-2B 细胞的凋亡 收集对数期C4-2B 细胞，调整细胞浓度并均匀接种于30 mm 培养皿中，使各皿细胞数为5×104个。给予0、0.25、0.5 ng·mL-1DHT 刺激，每48 h 换液1 次，于第5 天终止。收集细胞于1.5 mL 的EP管中。4 ℃、300×g 离心5 min，弃上清液，冷PBS清洗2 遍，每管加400 μL 的1×AnnexinV-FITC 结合液，调整细胞数为1×106个/mL。先后加入8 μL的AnnexinV-FITC 染液避光孵育15 min、5 μL 的PI 染液避光孵育5 min，孵育温度4 ℃。凋亡率使用流式细胞仪检测，数据用FlowJo 进行处理。

1.2.6 Western blot 检测C4-2B 细胞AR、ARV7、Bcl-2、BAX、c-caspase3、p-PI3K、p-AKT 蛋白表达 C4-2B 细胞处于对数生长期时收集并接种于60 mm 培养皿中，待细胞贴壁生长到50%～60%时，分别加入0、0.25、0.5 ng·mL-1DHT进行处理，设0 ng·mL-1DHT 为对照组，检测相关蛋白表达情况。抑制剂选用磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin ositol-3-kinase，PI3K）特异性抑制剂WM 干预，检测该通路的效应[8]。设0 ng·mL-1对照组、0.5 ng·mL-1DHT 处理组、3 μmol·mL-1WM 处理组、0.5 ng·mL-1DHT 和3 μmol·mL-1WM 联合处理组，刺激72 h。收集细胞，用含有蛋白酶、磷酸酶抑制剂的裂解液，冰上裂解细胞提取总蛋白，蛋白总量以具氰基丙烯酸正丁酯（BCA）法确定，以总体积的50%比例加入5 倍浓度蛋白上样缓冲液充分混匀，金属浴锅处理100 ℃8 min 后，变性蛋白储存于-20 ℃用于后续实验。以10%的SDS-PAGE 凝胶120 V 电泳条件分离蛋白，320 mA 恒流1 h 将不同分子质量蛋白转至0.45 μm 或0.22 μm 的PVDF 膜上；封闭液（5%脱脂奶粉）常温下封闭膜2 h，PBST 洗膜1 次，8 min；内参选择β-Actin（1∶2 000），分别加BAX（1∶10 000）、Bcl-2（1∶3 000）、c-caspase3（1∶1 000）、AR（1∶2 000）、AR-V7（1∶1 000）、p-PI3K（1∶2 000）、p-AKT（1∶2 000）、β-Actin 一抗孵育2 h，PBST 洗膜3 次，每次10 min；二抗（1∶5 000）孵育1 h，PBST 洗膜3 次，每次12 min；ECL 发光液制备，使用荧光图像分析仪曝光拍照。曝光后用Image J 进行条带灰度值检测，对目的蛋白灰度值与内参蛋白β-Actin 灰度值比值进行统计学分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间对比采用单因素方差分析（ANOVA）；以百分比（%）描述计数资料。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHT 抑制C4-2B 细胞增殖

细胞增殖活性结果显示，不同浓度DHT 处理C4-2B 细胞后，0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 ng·mL-1组存活率分别为（0.686±0.05）%、（0.590±0.06）%、（0.43±0.03）%、（0.415±0.03）%、（0.331±0.04）%、（0.218±0.03）%、（0.202±0.01）%、（0.193±0.01）%、（0.194±0.01）%，与对照组（0 ng·mL-1DHT）相比，DHT 浓度呈梯度增加时，各组C4-2B细胞的存活率均降低（P 均＜0.01）。在0.125、0.25、0.5 ng·mL-1各组［生理剂量范围（0.11～0.96 ng·mL-1）］间细胞存活率比较差异均具有统计学意义（P 均<0.01）；在1、2、4 ng·mL-1各组［超生理剂量范围（>0.96 ng·mL-1）］间细胞存活率差异也均具有统计学意义（P 均<0.05），而4、8、16 及32 ng·mL-1DHT 处理组间细胞存活率差异均无统计学意义（P 均>0.05），见图1。

图1 不同浓度DHT 对C4-2B 细胞存活率的影响

2.2 DHT 对C4-2B 细胞数量、形态的影响

选用0、0.25、0.5 ng·mL-1剂量DHT 处理C4-2B 细胞7 d。对照组（0 ng·mL-1DHT）C4-2B细胞生长状态好，呈梭形，细胞间相互接触，不易脱落，基本无漂浮细胞；0.25、0.5 ng·mL-1DHT 处理细胞后，可见贴壁细胞体积缩小、变圆，周围可见大量细胞碎片，细胞形状呈不规则改变，细胞贴壁能力减弱，易脱落，可见大量漂浮死细胞，整体细胞密度较对照组明显减少，见图2。

图2 不同浓度DHT 对C4-2B 细胞形态的影响（相差显微镜×100）

2.3 DHT 抑制C4-2B 细胞克隆形成能力

克隆形成实验结果显示，0.25、0.5 ng·mL-1DHT 处理组细胞克隆形成率分别为（16.67±1.7）%、（12.5±0.9）%，与对照组（0 ng·mL-1DHT）克隆形成率（22.7±1.9）%相比，克隆形成率均减少（P 均＜0.01），所形成的克隆体积较小、染色变浅，见图3。

图3 DHT 对C4-2B 细胞克隆形成能力的影响

2.4 DHT 增加C4-2B 细胞的凋亡率

流式细胞术测定凋亡结果显示，0.25 ng·mL-1DHT 组凋亡率［（9.83±0.70）%］低于0.5 ng·mL-1DHT 组凋亡率［（13.1±0.4）%］（P＜0.01），且0.25、0.5 ng·mL-1DHT 凋亡率均高于对照组（0 ng·mL-1DHT）［（7.19±0.80）%］（P 均＜0.01），见图4。

图4 DHT 对C4-2B 细胞凋亡的影响

2.5 DHT 对C4-2B 细胞凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2、c-caspase3 蛋白表达的影响

Western blot 检测各组凋亡相关蛋白结果显示，与对照组（0 ng·mL-1DHT）相比，C4-2B 细胞中0.25、0.5 ng·mL-1DHT 处理组Bcl-2 蛋白表达均下调（P 均＜0.05）；与对照组（0 ng·mL-1DHT）相比，0.25、0.5 ng·mL-1DHT 处理组BAX、c-caspase3 蛋白表达量均上调（P 均＜0.01），而0.25、0.5 ng·mL-1DHT 处理组BAX/Bcl-2 比值也增加（P均＜0.05），见图5。

图5 Western blot 检测DHT 对C4-2B 细胞Bcl-2、BAX、c-caspase3 凋亡相关蛋白表达的影响

2.6 DHT 对C4-2B 细胞p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 蛋白的表达的影响

Western blot 检测DHT 处理C4-2B 细胞后对照组及各DHT 处理组p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 蛋白表达结果显示，与对照组（0 ng·mL-1DHT）相比，0.25、0.5 ng·mL-1DHT 处理组C4-2B细胞p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 的蛋白表达量均下调（P 均＜0.05），见图6。

图6 Western blot 检测DHT 对C4-2B 细胞p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 蛋白表达的影响

2.7 DHT 通过抑制PI3K 信号通路抑制C4-2B细胞AR、AR-V7 蛋白表达，促细胞凋亡

Western blot 检测PI3K/AKT 通路相关蛋白、凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2、c-caspase3 以及AR、AR-V7 蛋白表达结果显示，单用DHT 或WM（3 μmol·L-1）处理C4-2B 细胞后，与对照组（0 ng·mL-1DHT）相比，BAX、c-caspase3 蛋白表达上调，同时Bcl-2、p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 蛋白表达水平下调（P 均＜0.05），并且0.25、0.5 ng·mL-1DHT 处理组BAX/Bcl-2 比值均增加（P 均＜0.05）。联合应用DHT（0.5 ng·mL-1）、WM（3 μmol·L-1）共同处理C4-2B 细胞，与单用DHT（0.5 ng·mL-1）或WM（3 μmol·L-1）组相比，上述蛋白趋势性变化更加明显（P＜0.01），见图7。

图7 DHT、wortmannin 单用或联合作用对C4-2B 细胞凋亡相关蛋白以及PI3K/AKT 通路蛋白表达的影响

3 讨论

雄激素剥夺理念最早由Huggins 提出，至今仍是PCa 的主要治疗方案[9]。但部分学者发现，给予不同剂量雄激素干预也会抑制PCa 细胞的增殖。Song 等[10]用不同浓度的睾酮和DHT 处理PCa细胞10 d 或20 d，AR 阳性的LNCaP 和MDAPCA2b细胞在DHT 生理水平范围内（0.11～0.96 ng·mL-1，MayoClinic）即表现出明显抑制效应；而AR 阴性的DU145 与PC3 细胞未见明显抑制效应。转染AR 于AR 阴性的PCa 细胞CWR22RV1 后，Isaacs等[11]观察到生理水平的雄激素可促其发生凋亡，提示在雄激素抑制PCa的增殖过程中，AR 信号的表达发挥关键作用。一项体内研究还发现，雄激素可抑制恩杂鲁胺耐药CRPC 移植瘤的增殖[12]。

C4-2B 细胞是由LNCaP 与骨基质细胞系细胞MS 相互作用得到的恶性程度较高的雄激素非依赖性细胞，其对激素不敏感并具有骨转移能力，可作为临床难治性PCa 的模型使用[13]。首先，使用对AR 具有高活性的DHT 作为靶向药物刺激C4-2B 细胞，浓度范围参考Song[10]的实验。CCK-8 结果提示，随着DHT 浓度增加，对C4-2B细胞增殖的抑制作用逐渐增强，在生理剂量内，呈浓度依赖性，在超生理剂量范围内，浓度依赖性不显著，即抑制作用存在一个平台期，继续增大DHT 浓度，抑制效应未见明显变化，这与Song 等[10]实验结果部分一致。因在生理剂量范围内，DHT对C4-2B 有抑制作用，因此本研究选择0.25 和0.5 ng·mL-1的DHT 进行后续实验。

显微镜下直接观察发现，DHT 处理细胞7 d后细胞贴壁能力变差、形态不规则、数量减少，提示可能与细胞凋亡增强有关。克隆形成实验结果显示C4-2B 克隆形成率可因DHT 的干预而降低。流式细胞术实验提示DHT 处理可使细胞凋亡率增加，提示生理浓度DHT 即可通过增加细胞凋亡水平抑制C4-2B 增殖。这与Joly-Pharaboz等[14]用合成雄激素类似物（R1881）100 和0.5 nm的DHT 处理LNCaP 细胞的结果相符。

细胞凋亡是由Bcl-2 家族介导的细胞程序性死亡过程，其中BAX、Bcl-2 以及活化的c-caspase3是参与此过程的重要蛋白，BAX/Bcl-2 是评估细胞凋亡的重要指标[15-16]。Western blot 结果显示，DHT 处理细胞后，c-caspase3 以及BAX 蛋白表达均上调，Bcl2 蛋白表达下调，BAX/Bcl2 比例增大；提示诱导细胞凋亡可能是DHT 抑制C4-2B细胞增殖的主要原因。

在PCa 的进展中，由于第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物的缺失，其下游信号通路PI3K/AKT 反复激活，是PCa 进展的重要诱因之一[17-18]。目前有研究[19]发现，PI3K/AKT 信号通路与AR 信号通路之间具有相关性。Liu 等[20]研究发现雄激素可通过PI3K/AKT 信号通路激活AR 诱导前列腺特异抗原（prostate specific antigen，PSA）的表达。本研究显示，给予DHT 处理C4-2B 细胞可引起p-PI3K、p-AKT、AR 蛋白表达量减少，可能是其诱导细胞凋亡的重要原因。给予PI3K特异性抑制剂WM 干预，p-PI3K、p-AKT、AR 表达量也减少，而细胞凋亡相关蛋白水平增加；DHT联合WM 干预后，p-PI3K、p-AKT、AR 表达下调更加显著，提示DHT 可能通过抑制PI3K/AKT/AR信号通路促进C4-2B 细胞的凋亡，从而抑制其增殖。本研究还显示，给予DHT、WM 联合干预后，AR-V7 与AR 呈现同样的变化趋势。AR 是配体依赖型的类固醇受体，但在去势条件下，其AR转录组可发生适应性改变，致缺乏配体结构域的AR剪接变异体转录增多，进而促PCa 细胞的增殖，这是CRPC 发生的重要原因之一[21-22]。提示DHT还可能通过抑制PI3K/AKT/AR-V7 信号通路促C4-2B 细胞凋亡。

综上所述，生理浓度DHT 可通过促进细胞凋亡，抑制C4-2B 细胞增殖，这可能与PI3K/AKT信号通路被抑制进而下调AR、AR-V7 有关；但AR、AR-V7 在此过程中的作用差异还有待进一步明确。本研究有望为CRPC 阶段的PCa 治疗提供简单而费用低廉的治疗措施线索。