PIP 对缺血性脑卒中大鼠皮质和海马Atg5、Atg14 自噬蛋白以及神经功能的影响

杨 妙， 张义伟， 原茜倩， 吕昊文， 陈飞飞， 杨建荣， 平洪璐， 刘 娟，3

（1.宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川 750004； 2.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；3.宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室，银川 750004）

脑梗死又称缺血性脑卒中，是由短暂或永久性的脑血管闭塞引起的局部供血减少或局部血栓形成[1]。尽管近年来缺血性脑卒中的临床治疗取得了进展，但该疾病仍然是导致全球老年人死亡或致残的主要原因[2]。黑胡椒是世界上最受欢迎的香料之一，属于胡椒科植物[3]。黑胡椒具有辛辣刺激的味道归因于含有2.0%～7.4%的胡椒碱（piperine，PIP），PIP 是其主要生物活性成分[4]。已发现PIP 具有抗氧化、免疫调节、抗癌、抗炎等特性[5]。并且该生物碱可抑制脑卒中后的炎症反应[6]以及凋亡[7]，但其对缺血性脑卒中的保护机制有待进一步研究。

自噬的激活在一些慢性神经退行性疾病中具有保护作用，但在急性神经疾病（如脑缺血性损伤）中则是有害的，因为它可以导致神经元的死亡[8]。因此，对自噬的干预显得尤为重要。本研究使用大鼠永久性大脑中动脉闭塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）模型，观察PIP 对缺血性卒中后神经功能恢复和自噬的影响，以期为开发治疗缺血性脑卒中的新药提供可靠的实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

无特定病原体（specific pathogen free，SPF）成年雄性Sprague-Dawley 大鼠（260～330 g）购自宁夏医科大学实验动物中心［许可证号：SCXK（宁）2015-0001；伦理编号：2018-011］。PIP 购自上海笛柏化学品技术有限公司（≥98%，规格：5 g），避光保存。全蛋白检测试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒和SDS-PAGE 快速凝胶配制试剂盒购自凯基生物公司。自噬相关基因（autophagy-related gene）Atg14 购自bioworld 公司，Atg5、β-actin 购自Cell Signaling Technology 公司。辣根过氧化酶标记的二抗购自北京天根公司，ECL 显影试剂购自凯基生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 30 只SD 雄性大鼠分为5 组：假手术组、模型组、10 mg·kg-1PIP 干预组、20 mg·kg-1PIP 干预组以及30 mg·kg-1PIP 干预组，每组6 只。

1.2.2 pMCAO 模型 术前禁食12 h，腹腔注射7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）。将大鼠麻醉后置于仰卧位。沿颈部中部纵向切开皮肤，钝性分离肌肉组织。暴露并分离右侧颈总动脉（common carotidartery，CCA）、颈外动脉（externalcarotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。ECA 和CCA 的近端用缝线小心地结扎。在CCA的远端做一个V 形切口，通过切口将光滑的26号尼龙线（1.7～1.8 cm）插入ICA 中，并结扎右侧CCA 的远端。肌肉皮肤逐层缝合，然后用医用酒精消毒。在整个手术过程中，大鼠用保温毯保持在37 ℃。大鼠醒来后进行Zea Longa 评分，得分为2 分的大鼠（可以观察到大鼠不断向左侧转圈行走）为成功的模型，被纳入实验，得分为0、1、3、4 分的大鼠被剔除。假手术组进行类似手术，但仅在CCA 的远端V 形切口处将尼龙线插入ICA 中约5 mm，未阻塞大脑中动脉。

1.2.3 配制方法 实验前将1、2、3 mg PIP 分别溶于1 mL 的5%羧甲基纤维素钠中，配置成1、2、3 mg·mL-1浓度的PIP 溶液，并换算成10、20、30 mg·kg-1（PIP 无毒剂量根据文献[9]确定）的给药浓度。假手术组和模型组给予0.9%生理盐水（1 mL/100 g），干预组给予PIP（1 mL/100 g），所有大鼠在缺血损伤后每天灌胃一次，连续14 d。

1.2.4 TTC 染色法检测大鼠大脑梗死面积 在第15 天将大鼠处死，取脑组织在-20 ℃冷冻15 min后作冠状切片。脑切片在2%TTC 中，37 ℃避光染色30 min。正常组织被染成红色，而梗塞区域被染成苍白色。使用Image J 测量梗塞面积。

1.2.5 Zea Longa 神经功能评分 纳入实验的大鼠分别在缺血损伤第3、6、9、12、14 天进行神经功能评分：0 分，正常（无神经功能损伤）；1 分，提尾时对侧前肢内收屈曲（轻度神经损伤）；2 分，不断向对侧转动（中度神经损伤）；3 分，不断向对侧倾倒（重度神经损伤）；4 分，无法自主行走并伴意识障碍或死亡。

1.2.6 Western blot 检测各组大鼠海马和皮层自噬相关蛋白表达水平 每组取3 只大鼠，共15 只。在第15 天将大鼠处死，快速剥离脑组织并取出海马和皮层，用全蛋白提取试剂盒提取各组蛋白，BCA蛋白定量后每组取30 μg 蛋白进行SDS-PAGE电泳、转至PVDF膜、5%脱脂牛奶封闭2 h、一抗（Atg5、Atg14 以及β-actin 以1∶1 000 比例稀释）4 ℃孵育过夜、二抗（以1∶20 000 比例稀释）孵育（1 h）及曝光等步骤，结果用Image J 进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One－way ANOVA），两两比较采用LSD－t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PIP 对缺血性脑卒中梗死面积的影响

TTC 染色结果显示，与假手术组相比，模型组梗死面积增加（P＜0.01）。与模型组相比，10、20、30 mg·kg-1PIP 干预组梗死面积均减小（P 均＜0.01），见图1。

图1 PIP 对缺血性脑卒中梗死面积的影响

2.2 PIP 对缺血性脑卒中神经功能的影响

Zea Longa 神经功能评分结果显示，第3、6、9、12、14 天与假手术组相比，模型组神经功能评分均升高（P 均＜0.01），证实模型成功。缺血损伤第12 天，与模型组相比，20 mg·kg-1和30 mg·kg-1PIP 干预组大鼠神经功能评分均下降（P 均＜0.05）。缺血损伤第14 天，与模型组相比，10、20、30 mg·kg-1PIP 干预组大鼠神经功能评分均下降（P 均＜0.05），见图2。

图2 PIP 对缺血性脑卒中神经功能的影响

2.3 PIP 对脑缺血引起海马损伤的自噬相关蛋白表达水平的影响

Western blot 结果显示，与假手术组相比，模型组Atg5 以及Atg14 的蛋白表达量上调（P 均＜0.05）。与模型组相比，20 mg·kg-1和30 mg·kg-1PIP 干预组Atg5 蛋白表达量下调（P 均＜0.05）。与模型组相比，10、20、30 mg·kg-1PIP 干预组Atg14 蛋白表达量均下调（P 均＜0.05），见图3。

图3 Western blot 检测海马自噬相关蛋白表达量

2.4 PIP 对脑缺血引起皮质损伤的自噬相关蛋白表达水平的影响

Western blot 结果显示，与假手术组相比，模型组Atg5 和Atg14 的蛋白表达水平均上调（P 均＜0.05）。与模型组相比，30 mg·kg-1PIP 浓度剂量的Atg5 蛋白表达水平下调（P＜0.05）。与模型组相比，20 mg·kg-1和30 mg·kg-1PIP 干预组Atg14 蛋白表达水平均下调（P 均＜0.05），见图4。

图4 Western blot 检测皮质自噬相关蛋白表达量

3 讨论

自噬是细胞受到刺激后，通过溶酶体途径降解细胞内物质的统称，自噬的发生取决于不同功能复合物之间的相互作用，这些复合物由几个不同的Atg 组成[10-11]。癫痫、阿尔茨海默病、脑缺血损伤等疾病的发生均与自噬相关[12-14]。缺血性脑卒中是由短暂或永久性的脑血管闭塞引起的脑损伤。有研究[15-16]报道，脑缺血损伤后脑区的自噬水平明显升高，而缺血性脑损伤后Atg5 和Atg14自噬相关蛋白水平升高[17-18]。本研究证实了这一结果，pMCAO 模型组大脑皮质的Atg5 和Atg14自噬蛋白表达量均升高，而实验组给予PIP 干预后Atg5 和Atg14 自噬蛋白表达量均下降，尤其是30 mg·kg-1PIP 干预组可抑制缺血性脑卒中14 d 后Atg5 和Atg14 自噬蛋白的表达。Rudolph 等[19]研究报道，成人神经发生失调的可能与中风损伤后的认知能力下降有关，而多数的研究集中在疾病对大脑皮层的影响，缺乏对海马研究的相关报道[20]。鉴于此，本研究对海马的Atg5 和Atg14 自噬蛋白表达进行定量分析，实验结果显示，pMCAO模型组海马的Atg5 和Atg14 自噬蛋白表达量也升高，实验组中给予PIP 干预后Atg5 和Atg14 自噬蛋白表达量均下降，与大脑皮质自噬蛋白表达趋势一致。大脑皮质和海马的实验结果显示，给予PIP 干预后对缺血性脑卒中引起的过度自噬具有抑制作用。Zea Longa 神经功能评分各PIP 干预组与模型组前6 d 相近，随着PIP 干预时间的延长，Zea Longa 神经功能评分逐渐下降，第14 天TTC染色PIP 干预组脑梗死面积缩小，尤其30 mg·kg-1PIP 干预组更为明显，说明给予PIP 干预后对亚急性期缺血性脑卒中发挥保护作用。综合以上实验结果，缺血性脑卒中大鼠给予PIP 干预后可以降低海马和皮质Atg5 和Atg4 自噬蛋白的表达，而Atg5 和Atg14 自噬蛋白对缺血性脑卒中保护作用的调节机制尚不清楚，需后续实验进一步探讨。