辅酶Q10对冠心病心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响

伊加提·司马义，帕合热丁·努尔麦麦提，阿布都乃比·麦麦提艾力

冠心病是指由冠状动脉血管发生粥样硬化所引起的血管狭窄、阻塞，从而造成心肌缺血、缺氧甚至坏死的心脏疾病，是临床上常见的心血管疾病[1]。心肌缺血再灌注损伤是冠心病病人围术期常见的临床并发症之一。心肌缺血再灌注损伤的发生不仅可影响再灌注的治疗效果，还可加剧脉管病变，甚至诱发恶性心律失常、心源性猝死，严重威胁病人生命安全[2]。辅酶Q10(CoQ10)是一种类似维生素的脂溶性物质，广泛存在于大多数细胞膜的磷脂双层的疏水内部[3]。研究显示，辅酶Q10主要通过增强相关线粒体活性，参与线粒体呼吸链作用，在三磷酸腺苷(ATP)合成中扮演着重要角色[4]。另有文献表明，辅酶Q10还可参与活性氧的清除，发挥脂质过氧化抑制作用，从而参与氧化应激的调节[5]。近年来，随着临床研究对CoQ10认识的不断深入，辅酶Q10被广泛用于各种心血管疾病的治疗，但其在冠心病心肌缺血再灌注损伤中的作用机制尚未阐明。本研究拟构建冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探究辅酶Q10对冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞凋亡的影响，进一步明确其对心肌细胞的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只成年无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠，体质量(200±20)g，均购于广东省动物实验中心。所有实验动物均于生物安全实验室分笼饲养，自由饮食饮水，保持室内安静、通风，12 h间隔照明，室温(20±2)℃，相对湿度(50±5)%。所有动物实验均经伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 辅酶Q10(国药准字H46020107，海南卓泰)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国Invitrogen公司)；实时荧光定量逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR试剂盒(TaKaRa公司)；兔抗鼠β-actin单克隆抗体、兔抗鼠B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)单克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体、兔抗鼠天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)单克隆抗体(Abcam公司)；原位末端标记法(TUNEL)试剂盒(美国Roche公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)、蛋白上样缓冲液(中国上海碧云天生物工程研究所)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型构建 采用高脂饮食饲养联合腹腔注射垂体后叶素构建大鼠冠心病模型：每日高脂饮食连续饲养6周后，间隔24 h给予腹腔注射垂体后叶素30 μg/kg，连续3次。所有实验大鼠随机分为假手术组、模型组、模型+辅酶Q10干预组(CoQ10组)，每组10只。假手术组：常规饮食，不进行冠心病和心肌缺血再灌注损伤造模，于左冠状动脉前降支行穿线处理，不进行结扎，术后以10 mg/(kg·d)生理盐水肌肉注射7 d。模型组：在冠心病建模基础上，于左冠状动脉前降支行穿线结扎，建立心肌缺血再灌注损伤模型，以结扎线远端心前壁苍白色、ST段抬高、T波高耸为缺血成功标志。缺血30 min后松开结扎线，以心肌缺血区恢复红润、ST段回落、T波恢复为再灌注成功的标志。术后以10 mg/(kg·d)生理盐水肌肉注射7 d。CoQ10组：在模型组建模基础上，术后给予10 mg/(kg·d)辅酶Q10肌肉注射7 d。

1.3.2 电化学发光试剂盒检测心肌损伤指标 取大鼠左颈动脉血2 mL，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液，根据电化学发光试剂盒要求，采用比色法检测大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等心肌损伤指标表达水平。

1.3.3 苏木素-伊红(HE)染色检测缺血区细胞形态 断头法处理实验大鼠，各组大鼠取适量心肌均匀切成5片，每片厚度约为2.0 mm，置于包埋盒内，浸于4%多聚甲醛中固定过夜。常规乙醇梯度脱水，随后取出，置于包埋机中2 h进行石蜡包埋。随后将切片置于二甲苯及梯度乙醇中依次浸泡脱蜡，采用苏木素染色40 s，1%盐酸乙醇冲洗后，置于伊红溶液中染色3 s，随后使用自来水冲洗。冲洗后将切片置于梯度乙醇及二甲苯溶液中进行脱水和透明处理。随后使用中性树脂覆盖玻片进行封固。于光学显微镜下观察并采集图片，应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件处理并作统计。

1.3.4 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测心肌梗死情况 取大鼠心脏悬挂于离体心脏灌注架上，采用37 ℃ K-H液灌注5 min，重新结扎左冠状动脉前降支，从主动脉逆行缓慢灌注0.5 mL 0.25%伊文思蓝溶液。-80 ℃充分冷冻心脏，从心尖部至结扎处切2 mm厚心肌组织切片，置于1% TTC溶液中，37 ℃恒温水浴孵育10 min，4%多聚甲醛固定12 h。梗死区呈现白色，缺血区呈现红色，于光学显微镜下观察并采集图片，并应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算心肌梗死面积与体积。

1.3.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数 将大鼠心肌组织以4%多聚甲醛固定过夜，双蒸水冲洗、脱水、脱乙醇、透明、石蜡包埋，制备厚度为2～3 μm切片，使用In Situ Cell Death Detection Kit进行TUNEL染色，滴加TUNEL反应液50 μL(enzyme solution及label solution按1∶9配制，即用即配，冰上操作)，保湿、避光、37 ℃下孵育60 min；PBS漂洗后，滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)至完全覆盖细胞以复染核；再次漂洗后，滴加抗荧光淬灭剂于载玻片上，将爬片倒扣在滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上封片，于光学显微镜下观察凋亡阳性细胞计数，凋亡指数=(视野内凋亡细胞数/视野内所有细胞数)×100%。所有实验重复3次。

1.3.6 心肌细胞线粒体膜电位检测 制备大鼠心肌细胞单细胞悬液，取1×105个细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，加入0.5 mL的罗丹明123染色液充分混匀。培养箱常规孵育15 min。4 ℃、1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次。500 μL PBS重悬细胞，使用流式细胞仪测定各组大鼠心肌细胞的线粒体膜电位的变化情况。以Rhodamine 123荧光强度反映线粒体膜电位改变情况。

1.3.7 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测mRNA表达 采用Trizol法提取大鼠心肌组织细胞总RNA。采用紫外分光光度仪测定总RNA浓度与纯度，A260/280在1.8～2.0。参照mRNA反转录试剂盒及SYBR®Premix Ex Taq TM试剂盒操作说明进行反转录和RT-qPCR检测，计算相对定量结果。所有试验重复3次，相对定量分析按照2-[△△Ct(实验组)-△△CT(对照组)]求出Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平。Bax、Bcl-2、Caspase-3引物及内参GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。

1.3.8 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达 取大鼠心肌组织约50 mg，加入组织蛋白提取液，4 ℃充分碾磨，10 000 r/min离心10 min，取上清液。线粒体蛋白提取采用线粒体蛋白提取试剂盒，心肌细胞蛋白提取使用RIPA裂解液。采用BCA蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量，各组以30～60 μg相同的蛋白上样量，煮沸变性后进行凝胶电泳，随后使用半干转仪转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，抗Bax单克隆抗体(1∶1 000)、抗Bcl-2单克隆抗体(1∶1 000)、抗Caspase-3单克隆抗体(1∶800)4 ℃孵育过夜。PBS-Tween 20液漂洗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗反应，PBS-Tween 20液洗膜，增强化学发光法(ECL)显色，凝胶成像仪曝光拍照。检测各组实验大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡标志蛋白以及线粒体蛋白p-Cx43表达情况。所有试验重复3次，灰度值采用Image Pro Plus 6.0软件检测分析。

2 结 果

2.1 3组大鼠心肌损伤指标表达水平比较 与假手术组比较，模型组和CoQ10组大鼠血清LDH、CK-MB表达水平均明显较高(P<0.05)；与模型组比较，CoQ10组大鼠血清LDH及CK-MB表达水平均明显降低(P<0.05)。详见表1。

表1 3组大鼠心肌损伤指标表达水平比较(±s) 单位：U/L

2.2 3组大鼠心肌组织细胞形态比较 光学显微镜下观察可见，假手术组大鼠心肌组织细胞排列相对整齐，细胞核膜完整，核仁清晰可见，无明显核固缩表现；模型组大鼠心肌组织细胞体积明显缩小，核固缩明显，呈深染色表现，细胞水肿明显，细胞间隙有明显的细胞浸润表现，可见明显的坏死细胞；CoQ10组大鼠心肌组织细胞水肿状态较模型组有所改善，细胞水肿状态呈现不同程度减轻，细胞核深染明显减轻，细胞皱缩明显缓解，细胞形态基本趋于正常。详见图1。

图1 3组大鼠心肌组织细胞形态比较(HE染色，×40)

2.3 3组大鼠心肌梗死情况比较 与假手术组比较，模型组和CoQ10组大鼠心肌梗死面积及梗死区体积均明显增大(P<0.05)；模型组大鼠心肌梗死面积、梗死区体积均明显大于CoQ10组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 3组大鼠心肌梗死情况比较(±s)

2.4 3组大鼠心肌细胞凋亡指数比较 TUNEL实验结果显示，与假手术组比较，模型组和CoQ10组大鼠TUNEL阳性细胞数、心肌细胞凋亡指数均明显升高(P<0.05)；模型组大鼠TUNEL阳性细胞数及心肌细胞凋亡指数均明显高于CoQ10组(P<0.05)。详见图2、图3。

图2 TUNEL染色观察凋亡阳性细胞情况

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

2.5 3组心肌细胞线粒体膜电位比较 与假手术组比较，模型组和CoQ10组心肌细胞荧光强度明显下降(P<0.05)；与CoQ10组比较，模型组心肌细胞荧光强度下降程度更明显(P<0.05)。详见图4。

图4 3组大鼠心肌细胞线粒体膜电位比较

2.6 3组大鼠心肌组织线粒体蛋白p-Cx43表达比较 Western Blot实验显示，与假手术组比较，模型组和CoQ10组大鼠心肌组织线粒体蛋白p-Cx43表达下调(P<0.05)；其中，CoQ10组大鼠心肌组织线粒体蛋白p-Cx43表达明显高于模型组(P<0.05)。详见图5。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

2.7 3组大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达情况比较 与假手术组比较，模型组和CoQ10组心肌组织Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)，且模型组大鼠心肌组织Bax及Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平高于CoQ10组(P<0.05)。模型组和CoQ10组大鼠心肌组织凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平明显低于假手术组(P<0.05)，模型组心肌组织Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平低于CoQ10组(P<0.05)。详见图6、图7。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

3 讨 论

冠心病是一类常见的严重危害人类健康的心血管系统疾病，其发生与动脉粥样硬化、血管再狭窄、心肌缺血再灌注损伤等密切相关[6]。心肌缺血再灌注是再灌注治疗后心肌损伤加重的病理现象，是影响冠心病病人临床治疗效果的重要原因之一，如何避免或减轻心肌缺血再灌注损伤的发生备受关注。近年来，有文献指出，心肌细胞凋亡在动脉粥样硬化和心肌缺血再灌注损伤等心血管系统疾病的发生、发展中扮演着重要角色[7]。近年来，随着对冠心病发病机制研究的不断深入，心肌细胞凋亡与冠心病的关系逐渐成为临床研究的热点。

辅酶Q10又名泛醌，于1957年被发现，是一种结构类似于维生素K的脂溶性醌，具有抑制细胞凋亡、抗氧化、增强免疫、保护神经系统等作用[8-9]。作为一种强抗氧化剂，辅酶Q10主要参与线粒体呼吸链的电子传递以及APT的合成，是人类生命不可缺少的重要元素[10]。辅酶Q10在心血管疾病的防治中应用广泛，作为线粒体氧化磷酸化的关键作用因子，辅酶Q10可在线粒体电子传递中将复合体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)辅酶Q还原酶传递到复合体细胞色素复合物bc1，作为电子传递的关键组成部分发挥ATP合成限速酶作用[11]。研究指出，心肌组织中辅酶Q10含量丰富，其消耗情况与机体心力衰竭程度密切相关，因而也被称为心肌细胞能量代谢的激活剂[12]。此外，辅酶Q10还具有高效的抗氧化作用，可通过与氧自由基直接作用，促进氧化型维生素的还原，从而有效避免氧自由基对线粒体DNA和线粒体膜蛋白的损伤[13]。张思洁等[14]的体外实验研究发现，辅酶Q10可抑制氧化应激条件下心肌细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平，提高心肌细胞存活率，降低细胞凋亡率，下调细胞凋亡蛋白表达，提高细胞中超氧化物歧化酶活性，提示辅酶Q10可抑制氧化应激诱导的心肌细胞损伤。有研究显示，辅酶Q10可抑制心肌细胞中氧自由基的产生并促进其降解，在心室功能和结构维持中具有保护作用，说明辅酶Q10在心肌细胞的凋亡抑制中具有一定作用[15]。王红等[16]采用异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌缺血损伤模型，于体内实验探究辅酶Q10作用，发现辅酶Q10预处理可通过增强 ATPase 活性、增强内源性抗氧化剂活性以及抑制心肌细胞的凋亡等机制在心肌缺血中发挥心脏保护作用，进一步证实辅酶Q10的心肌细胞保护作用。冯庆芝[17]在观察辅酶Q10治疗前后乙醇对兔心脏超声参数的影响时发现，辅酶Q10可分解过氧化氢(H2O2)，还原过氧化物，通过保护细胞膜结构和功能完整性，逆转心功能，发挥心肌保护。

除了抗氧化、减少氧化应激、抑制细胞凋亡等生理功能，本研究还关注到辅酶Q10的膜稳定剂作用，鉴于辅酶Q10在线粒体呼吸链中的作用，拟通过构建冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，于体内实验中验证辅酶Q10对心肌细胞凋亡的影响，并进一步探究辅酶Q10在线粒体膜稳定性中的作用。LDH和CK-MB是心肌组织损伤的主要标志物，其活性水平与细胞膜结构和功能完整性密切相关。本实验结果显示，辅酶Q10干预能改善血清LDH和CK-MB水平，降低心肌损伤标志酶活性，提示辅酶Q10可帮助维持细胞膜完整性和通透性，减轻心肌缺血再灌注引起的心肌损伤。且CoQ10组大鼠心肌梗死面积及梗死区体积明显小于模型组，TUNEL阳性细胞数、心肌细胞凋亡指数及凋亡蛋白表达明显低于模型组，进一步从大体标本和细胞水平证实辅酶Q10的心肌保护作用。心肌细胞损伤时线粒体膜电位可明显下调，为了更进一步探究辅酶Q10发挥心肌保护作用时对线粒体结构和功能的影响，本研究对心肌细胞线粒体膜电位进行了检测，结果显示，CoQ10组心肌细胞线粒体膜电位下降幅度明显小于模型组，且线粒体蛋白p-Cx43表达明显高于模型组。p-Cx43蛋白与线粒体功能稳定性相关，在线粒体膜通透性、线粒体细胞色素C释放和钙离子浓度调节中发挥作用[18]，提示辅酶Q10可在一定程度上维持线粒体稳定性，同时说明辅酶Q10的心肌细胞保护作用可能与p-Cx43蛋白功能有关。

综上所述，辅酶Q10对冠心病心肌缺血再灌注损伤大鼠具有重要的心肌保护作用，辅酶Q10可通过稳定线粒体膜结构和功能，提高心肌细胞线粒体膜电位，上调心肌细胞线粒体p-Cx43蛋白的表达，抑制心肌细胞凋亡，降低大鼠血清LDH和CK-MB活性，从而缩小心肌梗死面积，改善心功能，发挥心肌保护作用。